本发明涉及一种高效脱除苹果渣中展青霉素的生物脱毒方法，属于生物发酵脱毒技术领域。

背景技术：

展青霉素又称棒曲霉素(patulin，简称pat)，是一种有毒的的聚酮类次级代谢产物，其可以对包括人类在内的动物产生广泛的毒性作用。展青霉素可通过多种途径污染果蔬和农产品，其最常见的污染宿主为苹果。在世界范围内，苹果及其制品中的pat污染普遍存在，不仅发展中国家(南非、突尼斯、印度、阿根廷等)的苹果制品大量存在pat污染现象，而且美国、西班牙、意大利和日本等发达国家的苹果制品中同样存在pat污染。持续的展青霉素蓄积会危害人和动物的各器官组织甚至可能致癌，国际癌症研究中心将展青霉素列为第三类致癌物。霉菌毒素对人和动物的危害性和致癌性给农牧业的发展带来了巨大隐患，一定程度上限制了农牧产品进出口贸易的发展，会对果蔬，粮食作物、水产、畜牧、养殖业等造成巨大的经济损失。

我国是世界上最大的苹果生产国，近几十年来，我国苹果浓缩汁加工业发展迅速，在世界苹果浓缩汁产中占有相当突出的地位，其中世界苹果浓缩汁一半以上的产量和贸易量由我国主导。苹果浓缩汁加工过程中会产生大量的苹果鲜渣，我国每年形成的苹果鲜渣接近300万吨，是苹果渣的主要来源。苹果渣含有较高的水分和丰富的营养物质，易被曲霉菌侵染并产生展青霉素，极大地限制了苹果渣的广泛应用。动物食用污染的苹果渣食料会造成肝脏、肾脏、神经系统和免疫系统的损伤等影响。目前，世界卫生组织、欧盟及美国食药管理局规定，展青霉素在果汁中的最大限量为50μg/kg；同时，欧盟将苹果固态制品、苹果制成的婴儿食品中展青霉素的最大限量分别设置为25μg/kg、10μg/kg；我国将苹果、山楂制品中展青霉素的最大限量设定为50μg/kg。

展青霉素控制方法大致分为三类：物理方法、化学方法和生物方法。相比理化法消除展青霉素的缺点和局限，生物脱除法具有安全、高效和绿色环保等优点，使其成为更具有潜力的解毒方法。

技术实现要素：

本发明针对黑曲霉接种量、料水比、固态发酵温度、固态发酵时间，提供一种优化后能高效脱除苹果渣中展青霉素及增加苹果渣中营养价值的生物发酵脱毒方法，该方法脱毒效率高，改善营养价值，环保安全，在食品、饲料、生物脱毒方面均有应用前景，并可为展青霉素总量限量标准制定提供依据。

本发明的技术方案如下：

一种脱除苹果渣中展青霉素的方法，所述方法是向苹果渣中接种1％-20％的1×106cfu/ml黑曲霉孢子悬液，进行固态发酵；所述黑曲霉保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2013703。

在本发明的一种实施例中，所述的固态发酵温度为20～40℃。

在本发明的一种实施例中，所述的固态发酵时间为1～5d。

在本发明的一种实施例中，所述的固态发酵是加入无菌水至一定料水比下进行的。其中，料水比为1:2～1:4。料液比是指苹果渣质量与无菌水体积的比值，g/ml。

在本发明的一种实施方式中，所述黑曲霉孢子悬液是由含0.05％吐温-80的0.9％生理盐水洗脱孢子并稀释而成。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括：黑曲霉的培养；固态发酵苹果渣，将含有展青霉素的苹果渣粉碎过40目筛，进行高温高压灭菌后转移至发酵皿中，加入接种相应比例的1×106cfu/ml黑曲霉孢子悬液，加入相应比例无菌蒸馏水，搅拌均匀后，在适宜发酵温度下进行一定时间的固态发酵。

固态发酵(solidstatefermentation,ssf)是指在培养基呈固态,虽然含水丰富,但没有或几乎没有自由流动水的状态下进行的一种或多种微生物发酵过程。固态发酵是人类利用微生物生产产品历史最悠久的技术之一。

在本发明的一种实施例中，所述的黑曲霉培养的方法包括：将从-80℃取出的甘油管中黑曲霉接入pda固体培养基中活化3-7d。

在本发明的一种实施例中，所述的苹果渣粉碎后过40目筛。

在本发明的一种实施例中，所述的花生粕用高温高压灭菌锅121℃、20min灭菌。

在本发明的一种实施例中，所述的1×106cfu/ml黑曲霉孢子悬液是由含0.05％吐温-80的0.9％生理盐水洗脱孢子并稀释而成。

在本发明的一种实施例中，所述黑曲霉孢子悬液的接种比例为1％～20％，其中接种比例是指菌液体积与苹果渣质量的比值，ml/g。

在本发明的一种实施例中，所述的无菌水经过高温高压灭菌锅121℃、20min灭菌得到。

本发明的第二个目的是利用上述方法提供一种苹果渣产品。

本发明具有如下有益技术效果：

本发明首次将从酱醅中分离得到的具有脱除展青霉素效果的黑曲霉(cctccm2013703)应用于脱除苹果渣中展青霉素并改善其营养价值，配合特定的发酵条件，能够使得展青霉素的脱除率达99.6％、处理后的苹果渣中展青霉素残留量不仅符合国内限量标准，较高还符合欧盟制定标准；同时，该黑曲霉在固态发酵过程中不仅能够脱除展青霉素，在发酵过程中还产生了特殊的香气和提高苹果渣的营养价值。

附图说明

图1为发酵条件为不同黑曲霉接种量对展青霉素脱除率的影响；

图2为酵条件为不同的发酵温度对展青霉素脱除率的影响；

图3为发酵条件为不同的发酵时间对展青霉素脱除率的影响；

图4为发酵条件为不同的料水比对展青霉素脱除率的影响；

图5为各因素交互作用对展青霉素脱除率影响的响应面图；其中，a为接种量与发酵温度的交互作用响应面图，b为接种量与发酵时间的交互作用响应面图，c为接种量与料水比的交互作用响应面图，d为发酵温度与发酵时间的交互作用响应面图，e为发酵温度与料水比的交互作用响应面图，f为料水比与发酵时间的交互作用响应面图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

酱醅中黑曲霉的筛选方法：参见中国专利cn103937681b。该菌株已由本课题组于2013年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccm2013703，保藏地址为中国武汉大学。

黑曲霉cctccm2013703孢子悬液的制备：

(1)黑曲霉cctccm2013703培养：将从已保藏甘油管中黑曲霉cctccm2013703接入pda固体培养基中活化3-7d至状态良好；

2)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda培养基)：马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g、氯霉素0.1g、蒸馏水1l，121℃高压灭菌20min；

(3)然后利用含0.05％吐温-80的0.9％生理盐水洗脱稀释活化后的状态良好培养体系，得到106cfu/ml黑曲霉cctccm2013703孢子悬液。

实施例1

将含有展青霉素的苹果渣样品粉碎后过40目筛混合均匀，采用gb/t14699.1-2005方法采样并称取2.00g置于玻璃容器中，四层纱布报纸封口经高温高压灭菌锅121℃、20min灭菌处理。将灭菌处理过的苹果渣转移至发酵皿中，向上述处理后的样品加入比例为15％的1×106cfu/ml黑曲霉cctccm2013703孢子悬液(用含0.05％吐温-80的0.9％生理盐水洗脱稀释)，加入料水比为1:3的无菌蒸馏水，搅拌混合均匀后于30℃发酵温度下进行恒温固态发酵，在发酵4d后即得固态发酵后脱除展青霉素后的样品。

实施例2

将含有展青霉素的苹果渣样品粉碎后过40目筛混合均匀，采用gb/t14699.1-2005方法采样并称取2.00g置于玻璃容器中，四层纱布报纸封口经高温高压灭菌锅121℃、20min灭菌处理。将灭菌处理过的苹果渣转移至发酵皿中，向上述处理后的样品加入比例为10％的1×106cfu/ml黑曲霉cctccm2013703孢子悬液(用含0.05％吐温-80的0.9％生理盐水洗脱稀释)，加入料水比为1:3的无菌蒸馏水，搅拌混合均匀后于25℃发酵温度下进行恒温固态发酵，在发酵3d后即得固态发酵后即得固态发酵后脱除展青霉素后的样品。

实施例3

将含有展青霉素的苹果渣样品粉碎后过40目筛混合均匀，采用gb/t14699.1-2005方法采样并称取2.00g置于玻璃容器中，四层纱布报纸封口经高温高压灭菌锅121℃、20min灭菌处理。将灭菌处理过的苹果渣转移至发酵皿中，向上述处理后的样品加入比例为15％的1×106cfu/ml黑曲霉cctccm2013703孢子悬液(用含0.05％吐温-80的0.9％生理盐水洗脱稀释)，加入料水比为1:2.5的无菌蒸馏水，搅拌混合均匀后于30℃发酵温度下进行恒温固态发酵，在发酵4d后即得固态发酵后脱除展青霉素后的样品。

实施例4

将含有展青霉素的苹果渣样品粉碎后过40目筛混合均匀，采用gb/t14699.1-2005方法采样并称取2.00g置于玻璃容器中，四层纱布报纸封口经高温高压灭菌锅121℃、20min灭菌处理。将灭菌处理过的花生粕转移至发酵皿中，向上述处理后的样品加入比例为5％的1×106cfu/ml黑曲霉cctccm2013703孢子悬液(用含0.05％吐温-80的0.9％生理盐水洗脱稀释)，加入料水比为1:3的无菌蒸馏水，搅拌混合均匀后于35℃发酵温度下进行恒温固态发酵，在发酵4d后即得固态发酵后脱除展青霉素后的样品。

实施例5

将含有展青霉素的苹果渣样品粉碎后过40目筛混合均匀，采用gb/t14699.1-2005方法采样并称取2.00g置于玻璃容器中，四层纱布报纸封口经高温高压灭菌锅121℃、20min灭菌处理。将灭菌处理过的花生粕转移至发酵皿中，向上述处理后的样品加入比例为10％的1×106cfu/ml黑曲霉cctccm2013703孢子悬液(用含0.05％吐温-80的0.9％生理盐水洗脱稀释)，加入料水比为1:3.24的无菌蒸馏水，搅拌混合均匀后于31.2℃发酵温度下进行恒温固态发酵，在发酵3.9d后即得固态发酵后脱除展青霉素后的样品。

实施例6

将含有展青霉素的苹果渣样品粉碎后过40目筛混合均匀，采用gb/t14699.1-2005方法采样并称取2.00g置于玻璃容器中，四层纱布报纸封口经高温高压灭菌锅121℃、20min灭菌处理。将灭菌处理过的花生粕转移至发酵皿中，向上述处理后的样品加入比例为10％的1×106cfu/ml黑曲霉cctccm2013703孢子悬液(用含0.05％吐温-80的0.9％生理盐水洗脱稀释)，加入料水比为1:3的无菌蒸馏水，搅拌混合均匀后于30℃发酵温度下进行恒温固态发酵，在发酵4d后即得固态发酵后脱除展青霉素后的样品。

对实施例1-6方法的展青霉素脱除效果检测：以展青霉素(pat)脱除率为代表性检测指标。

收集发酵完成的样品，干燥后分别将每份苹果渣导入离心管内，加入10ml超纯水(ph＝4.0)进行提取并冲洗发酵皿一并导入离心管内，避免因苹果渣中毒素分布不均对实验结果的影响；室温下避光放置过夜后,加入10ml乙酸乙酯，涡旋混合5min，在6000r/min下离心5min，移取乙酸乙脂层至离心管中，再用乙酸乙酯提取一次，合并两次乙酸乙酯提取液后进行冷冻浓缩。用5.0ml超纯水(ph＝4.0)溶解残留物，过阴离子交换柱净化样品，收集液体后进行冷冻浓缩，用超纯水(ph＝4.0)复溶过滤膜后，上hplc检测。色谱条件：色谱柱：t3柱(150mm×4.6mm，3.0μm)流动相a为水，b为乙腈溶液，柱温：40℃，流速：0.8ml/min，进样量：20μl。洗脱条件参见表1。

表1梯度洗脱表

采用上述方法检测实施例1～实施例6脱除展青霉素后的样品中展青霉素的残留量，并计算出相应的脱除率。结果参见表2。

表2实施例1～实施例6脱除展青霉素后的样品中pat的脱除率

实施例7发酵工艺优化

按照单因素对照试验，分别针对黑曲霉种类、接种量、料水比、固态发酵温度、固态发酵时间进行优化选择：

图1是发酵条件为不同的接种量1％、5％、10％、15％、20％，控制料水比1：3，孢子悬浮液浓度为106cfu/ml，培养温度30℃，发酵时间3d时，展青霉素脱除率。

图2是发酵条件为不同的发酵温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，控制料水比1：3，孢子悬浮液浓度为106cfu/ml，接种量10％，发酵时间3d时，展青霉素脱除率。

图3是发酵条件为不同的发酵时间1d、2d、3d、4d、5d控制料水比1：3，孢子悬浮液浓度为106cfu/ml，接种量10％，培养温度30℃时，展青霉素脱除率。

图4是发酵条件为不同的料水比(苹果渣质量与无菌水体积的比值，g/ml)1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4，控制孢子悬浮液浓度为106cfu/ml，接种量(菌液体积与苹果渣质量的比值，ml/g)10％，培养温度30℃，发酵时间3d时，展青霉素脱除率。

由图1、2、3、4所示的条件优化可知：以展青霉素脱除率为指标，控制孢子悬浮液浓度为106cfu/ml，分别对接种量1、5、10、15、20％，发酵温度20、25、30、35、40℃，发酵时间1、2、3、4、5d，料水比(花生粕质量与无菌水体积的比值，g/ml)1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4进行试验，根据各因素的对展青霉素脱除情况影响，选择了适宜的发酵条件进行响应面优化。

图5是各因素交互作用对展青霉素脱除率影响的响应面图；其中，a为发酵温度与接种量的交互作用响应面图，b为接种量与发酵时间的交互作用响应面图，c为接种量与料水比的交互作用响应面图，d为发酵温度与发酵时间的交互作用响应面图，e为发酵温度与料水比的交互作用响应面图，f为料水比与发酵时间的交互作用响应面图。

结合图5，作具体的结果讨论分析：反映了四个因素对展青霉素脱除效果的影响存在两两交互作用，可以看出对于展青霉素脱除效果，接种量与料水比的交互作用显著，温度与时间、料水比的交互作用显著，时间与温度、料水比的交互作用显著，料水比与其他三个因素交互作用均显著。展青霉素脱除率可达98％以上。

对比例1不同方法对展青霉素脱除的效果

方法1：将实施例5中的黑曲霉cctccm2013703固体发酵脱除方法替换为超声波处理，其他条件不变，具体超声波处理过程参见高振鹏于2015年发表的文章(超声波降解苹果汁中展青霉素动力学研究.高振鹏,农业机械学报,2015,46(11):230-235)中记载的最优方法。

方法2：将实施例5中的黑曲霉cctccm2013703固体发酵脱除方法替换为臭氧处理，其他条件不变，具体臭氧处理过程参见李艳玲2011年发表的文章(三种失活酵母对苹果汁中展青霉素去除研究.董媛,食品工业,2013(1):116-118.)中记载的最优方法。

方法3：参照实施例5，将黑曲霉cctccm2013703替换为另一株黑曲霉cctccaf91009，其他条件不变，对苹果渣进行发酵脱除处理。采用上述相同测试方法检测经处理的样品中展青霉素的降解率，结果发现如表3所示。

表3不同方法脱除苹果渣中展青霉素的效果