本发明涉及微生物发酵
技术领域：
，尤其是涉及一种茶褐素液态发酵提取制备方法及茶褐素减肥固体饮料。
背景技术：
：肥胖是一种慢性的，复杂的疾病，其特征是由于高能量食物摄入量增加和运动减少导致脂肪过度的积累肥胖症，又称肥胖病，是一种社会性慢性疾病，目前其发生率在世界范围内急剧增加。目前，多种方法和策略已经被用于治疗肥胖症，其中包括改变生活方式（做出健康的饮食选择和增加运动），减肥手术和药物治疗。健康饮食和增加运动有益于预防和治疗肥胖症。但是，生活方式的改变需要自律和坚持，普通人可能很难做到这点。减肥手术，能够帮助病态肥胖患者显著的减轻体重，同时改善肥胖引发的心血管疾病和2型糖尿病。然而，减肥外科手术比较昂贵，并且具有一定的风险和副作用。鉴于生活方式的干预和减肥手术的局限性，药物治疗方法仍然是治疗肥胖的重要选择。肥胖给人类生活和经济发展都带来了不容忽视的危害，而目前在临床前研究或临床试验中正在研究的fda批准的药减肥药物的作用机制主要有：抑制食欲和卡路里摄入，增加能量消耗，减少脂肪吸收。前临床上被fda批准的减肥药种类不多，而且都存在一定的副作用，具有一定依赖性。超重和肥胖的发生率在世界范围内急剧增加，肥胖症给人类带来的危害已不容忽视，而目前市场上减肥药种类较少，并且存在较大的副作用，因此，寻找安全、有效、无毒的抗肥胖药物是迫切需要的。近年来，随着消费升级与健身经济迅速崛起，卡路里、低糖、减肥等关键词频繁地出现在日常生活之中，与此同时，在疫情影响之下，人们对自身健康的关注度上了一个新台阶。而随着消费者健康意识的不断提高，也让人们对自身的营养摄入与饮食结构有了更高要求。所以，以营养为基础调整饮食习惯，尊重食物与身体指标和平相处，达到健康管理是每日饮食的重要趋势。茶褐素是锈褐色且具有酚类性质的结构复杂高聚物，主要存在于渥堆发酵的黑茶和普洱茶等熟茶中。近年来，对其研究发现茶褐素具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗炎和抗肿瘤为主的生物活性，多方面的生物活性使其具有良好的应用前景，因此，寻找高效生产茶褐素的方式并全面了解其生物活性成为研究热点。目前，研究者通过改进普洱茶加工设备，模拟固态发酵过程，实现普洱熟茶自动化机械生产。利用双层保湿转动式发酵罐及不锈钢发酵罐，接种普洱熟茶发酵优势菌黑曲霉或自然发酵进行固态发酵，缩短发酵周期，生产甘、滑、醇、厚的普洱熟茶。发酵罐发酵可控化、清洁化程度高，可作为快速获得茶褐素的方法，但其得到的茶褐素纯度低，需进一步富集纯化；同时，研究者改进茶褐素的发酵生产方式，建立液态发酵工艺生产茶褐素，以茶多酚或茶水浸提液为发酵基质，采用酶催化生成茶褐素，利用塔宾曲霉粗酶液催化晒青毛茶水浸提液，使水浸提液中的酚类物质转化成茶褐素，反应便捷、生产周期短，但是酶制剂易失活且对反应条件较苛刻；利用茶叶自身菌体进行液态发酵，发现发酵液中茶褐素含量是发酵前的25倍，但此法生产周期较长，成本高，生产工艺复杂，产品质量不稳定。微生物液态发酵已在食品工业中广泛应用，利用特定微生物进行液态发酵生产茶褐素，具有易于控制、发酵时间短和防止杂菌污染等优势。低聚糖是一种天然的，能够被肠道微生物利用的益生元，也是一类水溶性膳食纤维，认可度广泛，食疗效果好，安全性高是一种重要的微生态调节剂，能够选择性的刺激肠内益生菌，抑制有害菌生长，够维护肠屏障功能，通过调节肠道菌群进而影响肥胖的发展。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种茶褐素液态发酵提取制备方法及茶褐素减肥固体饮料，解决目前利用黑曲霉发酵得到的茶褐素纯度低需要进一步富集纯化的问题，以及现有的普洱茶茶褐素固体饮料的口感不佳、热量较高的问题。为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：一种茶褐素液态发酵提取制备方法，包括有以下步骤：步骤1）：发酵罐空罐清洗灭菌；步骤2）：向发酵罐内投入普洱熟茶和水，进行搅拌溶料；步骤3）：对发酵罐内物料进行灭菌后冷却；步骤4）:向发酵罐内接种直投式菌株；步骤5）：进行液态发酵，得到发酵产物；步骤6）：将发酵产物经过滤、离心后得到澄清液；将澄清液进行真空浓缩后，喷雾干燥得到普洱茶茶褐素；优选的，步骤4）中所述的直投式菌株的制备包括有以下步骤：步骤s1：取植物乳杆菌接入脱脂牛奶培养基中，于40℃、180rpm/min条件下活化培养24h；步骤s2：将步骤s1活化所得菌液于无菌甘油中保存；步骤s3：将连续活化3代得到的植物乳杆菌菌液制备成直投式菌种；优选的，步骤4）中，向发酵罐接种直投式菌株的接种量为0.001～0.003%；优选的，步骤2）中投入普洱熟茶和水的料液比为：1：10～1：40；优选的，步骤5）中发酵的温度为40～42℃；搅拌速度为30rpm/min；发酵时间为3d～7d；优选的，步骤6）中，真空浓缩的温度为60～70℃，压力为0.05-0.10mpa；步骤6）中喷雾干燥的温度为160～180℃，流速为9-12l/min。本发明还提供一种茶褐素减肥固体饮料，包括有上述任一所述方法制备得到的普洱茶茶褐素；优选的，还包括有水溶膳食纤维、罗汉果甜苷和β-环状糊精；优选的，所述水溶性膳食纤维包括有低聚半乳糖、聚葡萄糖、低聚果糖和低聚木糖；优选的，按照重量份数，包括有0.1～2份普洱茶茶褐素、0.1～30份水溶性膳食纤维、0.03～0.05份和0.1～1份β-环状糊精。与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、利用普洱茶为主要原料，接种植物乳杆菌进行液态发酵，有利于缩短发酵时间，有利于提高发酵产物中茶褐素含量，有利于大幅度提高茶褐素生成效率；2、发酵料为普洱熟茶和水，接种植物乳杆菌进行液态发酵，发酵前不需要对普洱茶进行提取浓缩，发酵时不需要引入酶制剂，发酵反应条件易于控制，有利于简化制备工艺，有利于扩大工业应用范围；3、在发酵前先对发酵料进行灭菌，有利于减少茶叶中的自身菌体的液态发酵，有利于提高植物乳酸杆菌的发酵效率，有利于缩短生产周期，有利于提高茶褐素质量的稳定性；4、以普洱茶茶褐素为主要原料制备得到的茶褐素减肥固体饮料，应用于肥胖患者，有利于实现科学、安全、不挨饿、无痛苦的减肥。附图说明图1为料液比对茶褐素含量的影响结果图。图2为发酵时间对茶褐素含量的影响结果图。图3为发酵温度对茶褐素含量的影响结果图。图4（a）为服用茶褐素减肥固体饮料14天的体重变化图。图4（b）为服用茶褐素减肥固体饮料14天的体脂变化图。图4（c）为服用茶褐素减肥茶固体饮料14天的腰围变化图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1：一种茶褐素液态发酵提取制备方法，其包括有以下步骤：步骤1）：发酵罐空罐清洗灭菌；步骤2）：向发酵罐内投入普洱熟茶和水，进行搅拌溶料；步骤3）：对发酵罐内物料进行灭菌后冷却；步骤4）:向发酵罐内接种直投式菌株；步骤5）：进行液态发酵，得到发酵产物；步骤6）：将发酵产物经过滤、离心后得到澄清液；将澄清液进行真空浓缩后，喷雾干燥得到普洱茶茶褐素；进一步的，步骤4）中所述的直投式菌株的制备包括有以下步骤：步骤s1:取植物乳杆菌接入脱脂牛奶培养基中，于40℃、180rpm/min条件下活化培养24h；步骤s2：将步骤s1活化所得菌液于无菌甘油中保存；步骤s3：将连续活化3代得到的植物乳杆菌菌液制备成直投式菌种；进一步的，步骤4）中，向发酵罐接种直投式菌株的接种量为0.001～0.002%；进一步的，步骤2）中投入普洱熟茶和水的料液比为：1：10～1：40；进一步的，步骤5）中发酵的温度为40～42℃；搅拌速度为30rpm/min；发酵时间为3d～7d；进一步的，步骤6）中，真空浓缩的温度为60～70℃，压力为0.05-0.10mpa；步骤6）中喷雾干燥的温度为160～180℃，流速为9-12l/min。本实施例中，对发酵罐空罐的清洗是利用高压水枪对罐体内部外部进行清洗，再通过cip清洗系统清洗空罐，空气精过滤器灭菌、空消；空罐灭菌温度≥100℃，灭菌15min；本实施例中，溶料过程中的搅拌速度为150～180rpm/min；本实施例中，对发酵罐内物料进行灭菌温度≥100℃，灭菌15min；灭菌后需冷却至温度≤45℃，再进行接种。利用普洱茶为主要原料，接种植物乳杆菌进行液态发酵，有利于缩短发酵时间，有利于提高发酵产物中茶褐素含量，有利于大幅度提高茶褐素生成效率；发酵料为普洱熟茶和水，接种植物乳杆菌进行液态发酵，发酵前不需要对普洱茶进行提取浓缩，发酵时不需要引入酶制剂，发酵反应条件易于控制，有利于简化制备工艺，有利于扩大工业应用范围；在发酵前先对发酵料进行灭菌，有利于减少茶叶中的自身菌体的液态发酵，有利于提高植物乳酸杆菌的发酵效率，有利于缩短生产周期，有利于提高茶褐素质量的稳定性；以普洱茶茶褐素为主要原料制备得到的茶褐素减肥固体饮料，应用于肥胖患者，有利于实现科学、安全、不挨饿、无痛苦的减肥实施例2：茶褐素的测定方法茶褐素的提取方法参照红茶色素系统分析法，取3g普洱茶样品加入125ml沸水，水浴浸提10min（期间摇瓶２次），采用脱脂棉过滤，将滤液放在冷水中使其迅速冷却至室温。取4ml滤液于分液漏斗中，加入4ml正丁醇，充分振荡3min，静置分层。取下层水层0.4ml于具塞试管中，加入0.4ml饱和草酸、1.2ml蒸馏水、3ml95%乙醇，充分混匀，于380n处检测吸光度。以95%乙醇为空白对照组。按照以下公式计算茶褐素含量。茶褐素（%）=[（7.06×2×吸光度）÷（1-样品含水量）]×0.72实施例3：发酵料液比筛选按发酵液体积的5%接入发酵剂，普洱茶发酵料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40，在葡萄糖添加量为1%，发酵温度42℃的条件下发酵4d，将其低速离心取上清液进行喷雾干燥，根据实施例2的测定方法测定茶褐素含量，实验重复三次，实验结果如图1所示。料液比影响茶汤浓度，对微生物生长具有重大影响，料液比过小，茶汤浓度太高会导致菌丝生长受到抑制；而料液比过高，会影响微生物生存环境的渗透压以及不能提供足够的营养，严重限制微生物的生长繁殖，甚至引起死亡。在发酵温度和发酵时间一定的情况下，接种植物乳杆菌进行液态发酵，研究不同液料比对茶褐素含量的影响，结果如图1所示，茶褐素含量随料液比的增大先上升后下降，液料比在1:30时，茶褐素含量最佳，达到65.9%。实施例4：发酵时间筛选按发酵液体积的5%接入发酵剂，在料液比为1:30，葡萄糖添加量为1%，发酵温度为39℃，发酵时间0d至7d后，将其低速离心取上清液进行喷雾干燥，根据实施例2的测定方法测定茶褐素含量，实验重复三次，实验结果如图2所示。发酵时间过长或过短都会影响目标产物的合成，发酵时间过短产物积累较少或者目标产物还未合成，发酵时间过长导致产物降解或代谢产物合成方向改变。在以普洱茶为原料，按照一定的料液比和发酵温度，接种植物乳杆菌进行液态发酵，考察发酵时间对茶褐素含量的影响，结果如图2所示。随着发酵时间的延长，茶褐素含量不断增加，在发酵到第3d时，茶褐素含量达到最大值，因此，确定最适发酵时间为3d。实施例5：发酵温度筛选按发酵液体积的5%接入发酵剂，根据不同发酵温度（30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃、47℃），在葡萄糖添加量为1%，料液比1:30的条件下发酵3d，将其低速离心取上清液进行喷雾干燥，根据实施例2的测定方法测定茶褐素含量，实验重复三次，实验结果如图3所示。实施例6：对照实验茶发酵料液比为1:30，接种植物乳杆菌进行液态发酵，发酵温度45℃，发酵5d；根据实施例2的测定方法测定茶褐素含量，实验重复三次。对照组1：用水直接普洱熟茶中的茶褐素，根据实施例2的测定方法测定茶褐素含量，实验重复三次。对照组2：以茶水浸提液为发酵料，接种黑曲霉，调节发酵料液比和发酵温度适宜，发酵5d，根据实施例2的测定方法测定茶褐素含量，实验重复三次。上述三组实验测得的茶褐素含量结果如表1所示。表1茶褐素含量对比茶褐素含量（%）对照组137.89对照组29.978本发明71.53由表1可知，料液比1:30、发酵温度45℃，发酵时5d时，茶褐素含量达到71.53%。发酵后的茶褐素含量是水提物的1.88倍，是在茶水浸提取液中接种黑曲霉得到的茶褐素含量的xx倍。通过液态发酵，缩短发酵时间，大幅度提高茶褐素生成效率。实施例7：一种茶褐素减肥固体饮料，包括有普洱茶茶褐素、水溶膳食纤维、罗汉果甜苷和β-环状糊精；其中普洱茶茶褐素是以普洱熟茶为原料，发酵料液比为1:30，接种植物乳杆菌进行液态发酵，发酵温度45℃，发酵5d后，经过滤、离心后得到澄清液；将澄清液进行真空浓缩后，喷雾干燥得到普洱茶茶褐素。其中真空浓缩的温度为60～70℃，压力为0.05-0.10mpa；步骤6）中喷雾干燥的温度为160～180℃，流速为9-12l/min。本实施例中，在减肥固体饮料中添加罗汉果甜苷和β-环状糊精，有利于改善普洱茶茶褐素的口感，有利于避免使用砂糖等含糖，有利于降低茶饮料的热量，有利于增强减肥效果。所述水溶性膳食纤维包括有低聚半乳糖、聚葡萄糖、低聚果糖和低聚木糖；本实施例中，在茶饮料中添加水溶性膳食纤维，有利于降低饮料热量，有利于提高饱腹感，增强肠胃蠕动，有利于和茶褐素产生协同作用，提高减肥效果。实施例8：一种茶褐素减肥固体饮料，按照重量份数，包括有0.1～2份普洱茶茶褐素、0.1～30份水溶性膳食纤维、0.03～0.05份和0.1～1份β-环状糊精。实施例9：茶褐素减肥固体饮料的应用按实施例8提供的茶褐素减肥随餐茶组合物配制减肥固体饮料，邮寄给体验者，并要求填写体验记录表，随餐饮用；通过可穿戴设备或者手机对减肥者进行基础数据统计，了解其基本身体情况，判定肥胖等级；通过体重秤及体脂称，对减肥者进行身体监测，了解其身体各方面指标；根据监测结果及体验记录表，分析茶褐素减肥固体饮料减肥效果结果表明：茶褐素减肥固体饮料14天减肥效果如图4所示，五位不同年龄体验者连续服用14d后，体重、体脂、腰围都随之下降，说明茶褐素减肥固体饮料有一定的降脂减肥作用，且随着服用天数的增加，降脂减肥效果越明显。下面根据临床案例对本发明作进一步说明∶1、苗某，女性，21岁，云南省昆明市盘龙区人，不喜运动，起始体重53.3kg，连续服用本品14d，每天24g，体重下降0.9kg，体脂下降2%，腰围减小5cm；2、魏某，女性，23岁，云南省昆明市官渡区人，爱吃零食，起始体重55.1kg，连续服用本品14d，每天24g，体重下降1.3kg，体脂下降2.1%，腰围减小3.4cm；3、董某，女性，32岁，云南省楚雄市大姚县，现住昆明，上班族，没时间运动，起始体重55.85kg，连续服用本品14d，每天24g，体重下降1.05kg，体脂下降1.5%，腰围减小1.8cm；4、廖某，女性，25岁，云南省文山州丘北县，现住昆明，减肥困难，起始体重54.1kg，连续服用本品14d，每天24g，体重下降1.6kg，体脂下降1.7%，腰围减小6cm；5、王某，男性，23岁，云南省昆明市盘龙区人，起始体重55.85kg，体脂高，连续服用本品14d，每天24g，体重下降1.5kg，体脂下降4.5%，腰围减小3cm。尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。当前第1页1 2 3