本发明涉及天然产物生物分离技术领域，具体涉及一种北美车前中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物的方法。

背景技术：

北美车前是车前科车前属草本植物，又称“毛车前”，原产于北美洲，是我国南方分布广泛的一种入侵植物，正呈爆发式增长态势，对自然保护区的生态造成较为严重的影响，北美车前之所以能够迅速成为某一生态环境的优势植物，是因为其含有较为丰富的化感物质，化感物质种类众多，能够影响其他植物生长的各个过程及不同的生理过程，从另一方面来说，运用不同化感物质对某一类植物生长繁殖抑制作用的特性，可以将其用作天然除草剂，减少化学除草剂的使用，有利于保护生态环境。

此外，北美车前植株中含有多种类型的苯乙醇苷类化合物，苯乙醇苷类化合物属于糖苷类化合物，含有咖啡酸亦被称为咖啡酸苷、苯丙素苷类化合物，其具有多种生物活性，例如抗氧化、抗菌、抗炎、抗高血压、抗衰老、增强免疫力、抗肿瘤、降低尿酸等药理作用。

对于北美车前中化感物质的提取，目前报道均采用简单的水浸提，然后使用该水浸提液对植物种子或者其他植物发生作用，而无法将水浸提液浓缩干燥后，加工厂固体，待需要使用时再用水复溶，对于北美车前中苯乙醇苷类化合物的提取，目前报道采用乙醇浸提后，再使用树脂进行富集和纯化，浸提时间过长，导致浸提液中杂质含量高，并且也没有对北美车前中的化感物质和苯乙醇苷类化合物同时提取的工艺，因此，需要开发一种北美车前中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种北美车前中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物的方法，以解决现有技术中的上述不足之处。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种北美车前中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物的方法，包括以下步骤：

步骤1)北美车前的采集：从自然保护区中采集新鲜北美车前植株，用水洗去泥沙等杂质；

步骤2)浸泡：将步骤1)得到的北美车前植株浸泡在0.05～0.1mol/l的碳酸氢钾溶液中，固液比为1:3～1:6，浸泡时间为10～28min，浸泡温度为16～22℃，得到浸泡后的北美车前植株；

步骤3)水浸提取化感物质：将步骤2)浸泡后的北美车前植株加入去离子水中，固液比为1:5～1:10，搅拌转速为16～32转/min，完成后进行固液分离，得到水浸提液和水浸提后的北美车前植株；

步骤4)水浸提液净化：向步骤3)得到的水浸提液中加入石油醚进行叶绿素萃取，加入量为水浸提液重量的10％～20％，温度为10～15℃，搅拌使两相乳化，萃取时间为30～50min，完成后静置，使两相充分分离，得到净化后的水浸提液；

步骤5)水浸提液过滤除杂：将步骤4)净化后的水浸提液用微滤膜过滤除杂，得到过滤后水浸提液；

步骤6)水浸提液的减压浓缩：将步骤5)的过滤后水浸提液泵入旋转蒸发器中，在真空度为-70kpa以下，温度75℃以上的条件下减压浓缩，得到含化感物质的膏状物，将含化感物质的膏状物置于真空干燥箱中，在真空度为-80kpa以下，温度82℃以上的条件下，干燥至含水量低于5％，得到化感物质固体；

步骤7)水浸提后的北美车前植株的适度干燥：将步骤3)水浸提后的北美车前植株放入流化床内，从流化床底部通入50～60℃的干燥空气，空气通入的流量为80～100倍流化床层体积/h，使水浸提后的北美车前植株的含水量降低至15％～20％；

步骤8)醇浸提取苯乙醇苷类化合物：将步骤7)的北美车前植株浸入乙醇溶液中，溶液中乙醇的质量百分数为78％～82％，余量为水，固液比为1:4～1:6，醇浸温度32～51℃，醇浸时间3～6h，固液分离后得到醇浸提液；

步骤9)苯乙醇苷类化合物的分离纯化：将步骤8)的醇浸提液放入蒸馏装置中，将其中的乙醇蒸出，使乙醇的质量百分含量低于5％，得到苯乙醇苷类化合物溶液，再加入与到苯乙醇苷类化合物溶液等体积的去离子水，然后利用大孔吸附树脂对溶液中的苯乙醇苷类化合物进行吸附，用醇溶液洗脱，得到含苯乙醇苷类化合物的洗脱液；

步骤10)浓缩干燥：将步骤9)得到的含苯乙醇苷类化合物的洗脱液进行蒸发浓缩，得到苯乙醇苷类化合物固体。

进一步地，步骤1)北美车前包括生长于自然保护区中的野生植株。

进一步地，步骤2)碳酸氢钾溶液的浓度为0.06～0.08mol/l，浸泡时间为18～22min，浸泡温度为19～21℃。

优选的，步骤2)浸泡完成后使用直径0.6～0.8m的尼龙绞笼在转速20～28转/min下离心2～6min，以去除表面溶液，采用碳酸氢钾溶液对新鲜北美车前植株进行浸泡的作用是：使北美车前植株外层的包膜致密度降低，增加其通透性，同时还可以使细胞壁的通透性增加，降低化感物质从植株内和细胞内向水浸提液相的传递，加快提取速度。

进一步地，步骤2)后可以增加对北美车前植株的揉制步骤，揉制步骤采用市售的茶叶揉制装置。揉制装置的转速为20～30转/h，揉制的温度为40～55℃，揉制之间为30～40min。其作用是：通过缓慢地揉制，使北美车前植株内不同组织间的包膜破裂，进一步降低化感物质和苯乙醇苷类化合物从植株内向植株外的传质阻力。

进一步地，步骤2)后还可以增加压力脉动步骤，压力脉动是将北美车前植株放置在密封的承压容器中，然后向承压容器内注入一定压力的气体，再瞬间泄压，气体的压力为0.8～1.4mpa，加压周期为4～8s，泄压周期为2～3s，对北美车前进行压力脉动的时间为30～50min。进一步优选地，气体为惰性气体，包括氮气、二氧化碳、去除氧气的空气等。压力脉动的作用是：在北美车前细胞壁和细胞膜上形成微小裂纹，进步提高植株内外传质速度。

优选的，步骤3)水浸提的温度为40～60℃，浸提时间为3～5h。优选地，水浸提的温度为46～51℃，浸提时间为4.1～4.4h。

进一步地，步骤3)的水浸提进行多个批次，包括3批次、4批次等。以进行3批次为例，3批次的固液比均为1:2，第一批次水浸提的搅拌转速为16～18转/min，温度为40～48℃，浸提时间为0.6～1.1h；第二批次水浸提的搅拌转速为20～28转/min，温度为46～52℃，浸提时间为0.8～1.0h；第三批次水浸提的搅拌转速为26～32转/min，温度为54～60℃，浸提时间为0.9～1.2h。最后将各批次浸提液混合，得到水浸提液。其作用是提高浸提速度，减少浸提用水量，增加化感物质的浸提率。

优选的，步骤4)的石油醚包括沸程为60～90℃的石油醚。

进一步地，步骤4)后可以增加醇沉步骤，目的是去除水浸提液中多糖、胞外多聚物等高分子量杂质。醇沉的具体操作是向水浸提液中加入无水乙醇，使其中乙醇的质量百分数浓度达到78％～81％，发明人发现，在该乙醇浓度下，对北美车前水浸提液中的多糖、胞外多聚物的去除效果最好。采用醇沉去除北美车前水浸提液中多糖、胞外多聚物后，能够使提取的化感物质更加易于干燥，从而能够长时间保存并且保持其生物活性，采用水复溶后，仍然具有生物活性。

优选的，步骤5)的微滤膜的孔径为0.45～1.0微米的微滤膜，包括聚四氟乙烯微滤膜，其作用是：去除水浸提液中的颗粒物质、蛋白质和核酸类物质形成的胶束，提高化感物质的纯度。

优选的，步骤7)的流化床的径高比为1:8～1:10。

优选的，步骤8)的醇浸温度32～51℃。

进一步地，步骤8)的醇溶液，可以是乙醇和丙醇混合溶液中，混合溶液中乙醇的质量百分含量为60％～70％，丙醇的质量百分含量为8％～22％，余量为水。其作用是提高苯乙醇苷类化合物的浸出率。

优选的，步骤9)大孔吸附树脂包括d4006、d4020和nka-ⅱ中的至少一种。优选地，大孔吸附树脂包括d4020和nka-ⅱ的混合物，其质量比为2:1～3:1。

进一步地，步骤9)的吸附树脂装入玻璃层析柱中，玻璃层析柱的径高比为1:10～1:17，树脂的填充率为78％～86％，吸附温度为10～18℃，吸附操作的上柱液流速为2～3个柱体积/h。洗脱液为乙醇和丁醇的混合溶液，乙醇的质量百分数为43％～55％，丁醇的质量百分数为6％～12％，洗脱温度为28～34℃，洗脱操作的洗脱液流速为1.6～2.3个柱体积/h。

进一步地，步骤7)至步骤10)是在惰性气体保护下进行的，惰性气体包括氮气、二氧化碳，以及去除氧气的空气等。

在上述技术方案中，本发明提供的技术效果和优点：

本发明通过以入侵植物北美车前为原料，提取化感物质和苯乙醇苷类化合物，既消除北美车前对自然保护区环境的危害，又能得到可用于天然除草剂的化感物质，并且得到的化感物质纯度较高，能够浓缩干燥成固体粉末，再行复溶使用；还同时得到具有抗炎症、抗肿瘤等生物活性的品质较好的苯乙醇苷类化合物，并且使其醇浸提时间大幅缩短，一举三得。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明北美车前中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物的方法的流程示意图。

图2为本发明北美车前中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物的方法其中一个实施例的流程示意图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。

实施例1～5

采用如下方法从北美车前中同时提取化感物质和苯乙醇苷类化合物：

步骤1)北美车前的采集：从自然保护区中采集新鲜北美车前植株，用水洗去泥沙等杂质；

步骤2)浸泡：将步骤1)得到的北美车前植株浸泡在碳酸氢钾溶液中，完成后使用尼龙绞笼去除表面溶液，得到浸泡后的北美车前植株，碳酸氢钾溶液的浓度、固液比、浸泡时间、浸泡温度、绞笼直径、转速和时间等参数如表1所示；

步骤3)水浸提取化感物质：将步骤2)浸泡后的北美车前植株加入一定温度的去离子水中，完成后进行固液分离，得到水浸提液和水浸提后的北美车前植株，浸提温度、固液比、搅拌转速、浸提时间等参数如表2所示；

步骤4)水浸提液净化：向步骤3)得到的水浸提液中加入石油醚进行叶绿素萃取，搅拌使两相乳化，完成后静置，使两相充分分离，得到净化后的水浸提液，石油醚沸程、加入量、萃取温度、时间等参数如表3所示；

步骤5)水浸提液过滤除杂：将步骤4)净化后的水浸提液用微滤膜过滤除杂，得到过滤后水浸提液，微孔滤膜的孔径和材质等参数如表3所示；

步骤6)水浸提液的减压浓缩：将步骤5)的过滤后水浸提液泵入旋转蒸发器中，在一定真空度和温度的条件下减压浓缩，得到含化感物质的膏状物，将含化感物质的膏状物置于真空干燥箱真空干燥，得到化感物质固体，旋转蒸发的真空度、温度、真空干燥的真空度、温度和干燥后的含水量等参数如表4所示；

步骤7)水浸提后的北美车前植株的适度干燥：将步骤3)水浸提后的北美车前植株放入流化床内，从流化床底部通入一定温度的干燥气体，在一定流量下对水浸提后的北美车前进行干燥，使其植株的含水量降低至一定含量以下，流化床的高径比、气体温度、流量和植株含水量等参数如表5所示；

步骤8)醇浸提取苯乙醇苷类化合物：将步骤7)的北美车前植株浸入乙醇溶液中进行醇浸，固液分离后得到醇浸提液，溶液中乙醇的质量百分数、固液比、醇浸温度、醇浸时间等参数如表6所示；

步骤9)苯乙醇苷类化合物的分离纯化：将步骤8)的醇浸提液放入蒸馏装置中，将其中的乙醇蒸出，使乙醇的质量百分含量低于一定数值，得到苯乙醇苷类化合物溶液，再加入与苯乙醇苷类化合物溶液等体积的去离子水，然后利用大孔吸附树脂对溶液中的苯乙醇苷类化合物进行吸附，用醇溶液洗脱，得到含苯乙醇苷类化合物的洗脱液，乙醇的质量百分含量、大孔吸附树脂的种类及其比例等参数如表7所示；

步骤10)浓缩干燥：将步骤9)得到的含苯乙醇苷类化合物的洗脱液进行蒸发浓缩，得到苯乙醇苷类化合物固体。

表1实施例中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物方法的主要操作参数(一)

表2实施例中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物方法的主要操作参数(二)

表3实施例中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物方法的主要操作参数(三)

表4实施例中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物方法的主要操作参数(四)

表5实施例中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物方法的主要操作参数(五)

表6实施例中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物方法的主要操作参数(六)

表7实施例中提取化感物质和苯乙醇苷类化合物方法的主要操作参数(七)

采用上述实施例的方法，得到北美车前的化感物质和苯乙醇苷类化合物，化感物质的纯度、苯乙醇苷类化合物的提取率和纯度如表8所示，苯乙醇苷类化合物的提取率以北美车前中含有的所有苯乙醇苷类化合物为基准。

表8本发明的各实施例取得的技术效果(一)

实施例6～7

实施例6～7中采用的基础操作参数与实施例2相同，在步骤2)后增加对北美车前植株的揉制步骤，采用市售的茶叶揉制装置进行操作。

实施例6的揉制装置的转速为20转/h，揉制的温度为55℃，揉制之间为30min。结果显示，水浸提的时间由5h减少到3.8h，苯乙醇苷类化合物的提取率由76.4％提高到82.6％，醇浸提的时间由3h减少到2.1h。

实施例7的揉制装置的转速为30转/h，揉制的温度为40℃，揉制之间为40min。结果显示，水浸提的时间由5h减少到3.3h，苯乙醇苷类化合物的提取率由77.2％提高到83.9％，醇浸提的时间由3h减少到1.9h。

实施例8～9

本实施例中采用的基础操作参数与实施例3相同，在步骤2)后增加对北美车前植株的压力脉动处理步骤，压力脉动是将北美车前植株放置在密封的承压容器中，然后向承压容器内注入一定压力的气体，再瞬间泄压。

实施例8的压力脉动参数如下：气体的压力为1.4mpa，气体为氮气，加压周期为4s，泄压周期为2s，对北美车前进行压力脉动的时间为50min。结果显示，水浸提的时间由4.1h减少到2.8h，苯乙醇苷类化合物的提取率由73.3％提高到86.9％，醇浸提的时间由4.5h减少到1.2h。

实施例9的压力脉动参数如下：气体的压力为0.8mpa，气体为去除氧气的空气，加压周期为8s，泄压周期为3s，对北美车前进行压力脉动的时间为30min。结果显示，水浸提的时间由4.1h减少到3.0h，苯乙醇苷类化合物的提取率由73.3％提高到85.6％，醇浸提的时间由4.5h减少到1.3h。

实施例10

本实施例中采用的操作参数与实施例3相同，在步骤2)后增加对北美车前植株的揉制步骤，操作参数同实施例6，在步骤2)后增加对北美车前植株的压力脉动处理步骤，操作参数同实施倒8。

结果显示，水浸提的时间由4.1h减少到1.6h，苯乙醇苷类化合物的提取率由73.3％提高到92.7％，醇浸提的时间由4.5h减少到0.9h。

实施例11

本实施例中采用的基础操作参数与实施例4相同，步骤3)的水浸提进行3个批次，3批次的固液比均为1:2，第一批次水浸提的搅拌转速为16转/min，温度为48℃，浸提时间为0.6h；第二批次水浸提的搅拌转速为26转/min，温度为58℃，浸提时间为0.8h；第三批次水浸提的搅拌转速为32转/min，温度为60℃，浸提时间为0.9h最后将各批次浸提液混合，得到水浸提液。结果表明，采用上述工艺可使水浸提时间大幅缩短。

实施例12

本实施例中采用的基础操作参数与实施例5相同，步骤4)后增加醇沉步骤，目的是去除水浸提液中多糖、胞外多聚物等高分子量杂质，醇沉的具体操作是向水浸提液中加入无水乙醇，使其中乙醇的质量百分数浓度达到79％，然后过滤去除固体沉淀。结果显示，化感物质的纯度由66.5％提高到90.1％。采用醇沉去除北美车前水浸提液中多糖、胞外多聚物后，提取的化感物质易于干燥，形成分散的粉末，从而能够长时间保存并且保持其生物活性，采用水复溶后，仍然具有生物活性。

实施例13

除下文记载的操作参数外，本实施例中采用的其他基础操作参数与实施例1相同。

步骤8)的醇溶液是乙醇和丙醇混合溶液，溶液中乙醇的质量百分含量为66％，丙醇的质量百分含量为14％，余量为水。结果显示，苯乙醇苷类化合物的提取率由72.1％提高到86.7％。

实施例14

除下文记载的操作参数外，本实施例中采用的其他基础操作参数与实施例3相同。

步骤9)的吸附树脂装入玻璃层析柱中，玻璃层析柱的径高比为1:14，树脂的填充率为81％，吸附温度为16℃，吸附操作的上柱液流速为2个柱体积/h。洗脱液为乙醇和丁醇的混合溶液，乙醇的质量百分数为50％，丁醇的质量百分数为9％，洗脱温度为30℃，洗脱操作的洗脱液流速为2.3个柱体积/h。结果显示，苯乙醇苷类化合物的纯度由89.3％提高到93.6％。

对比例1

采用现有技术的方法从北美车前中提取化感物质，含化感物质的水浸提液经浓缩后，得到黏稠的膏状物质，无法进一步干燥为固体粉末，经测试，其中多糖类物质的含量高达63％；经长时间存放后，板结为坚硬的块状物质，再行溶解于水的过程需要较长时间，经生物活性测试，结果表明其生物活性仅为初始状态的32％。

对经过化感物质提取的北美车前植株进一步采用现有技术的醇浸提，提取其中的苯乙醇苷类化合物，经测试，苯乙醇苷类化合物的提取率仅为49％(以新鲜北美车前中含有苯乙醇苷类化合物为基准)，其原因为水浸提的温度过高、时间较长，导致苯乙醇苷类化合物损失、变性，导致其生物活性降低。

采用现有技术的方法从北美车前中提取苯乙醇苷类化合物，需要采用乙醇水溶液回流提取，温度(大于80℃)高，能耗高，耗时长(醇浸泡和回流时间大于14h)；

综上所述，以入侵植物北美车前为原料，提取化感物质和苯乙醇苷类化合物，既消除北美车前对自然保护区环境的危害，又能得到可用于天然除草剂的化感物质，并且得到的化感物质纯度较高，能够浓缩干燥成固体粉末，再行复溶使用；还同时得到具有抗炎症、抗肿瘤等生物活性的品质较好的苯乙醇苷类化合物，并且使其醇浸提时间大幅缩短，一举三得。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。