本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体地说，它涉及一种草莓脱毒育苗方法。

背景技术：

草莓是蔷薇科草莓属宿根性多年生常绿草本植物，属于多倍体，是一种靠匍匐茎进行无性繁殖的作物，传统种苗培育的方法是采用匍匐茎繁殖的无性繁殖方式，效率较低，不利于优良品种的推广，而且极易感染病毒。我国已鉴定明确的草莓病毒有四种，即草莓斑驳病毒(smov)、草莓轻型黄边病毒(smyev)、草莓皱缩病毒(scrv)和草莓镶脉病毒(svbv)。四种苗普遍感染病毒是草莓生产中的瓶颈问题，感染病毒的草莓比未感染病毒的草莓长势弱、抗性差、产量明显下降，果品品质与商品性状变劣。对于病毒病，目前还没有药剂可以治理，因此，培育无病毒母本苗、栽培无病毒苗木是防治草莓病毒病的根本对策。

目前，无病毒母本苗主要是通过草莓脱毒组培技术，即通过花药组织培养、微茎尖组织培养等技术脱去病毒病原获得无毒草莓再生植株，使草莓种苗恢复品种原种优良种性，以达到优质、高产之目的。然而草莓无病毒母本苗培育不易，组织培养的外植体选用有缺陷，培养过程中的条件控制不足等，就会造成脱毒效果差、污染、玻璃化、繁育系数低、移栽成活率不高等问题，给生产造成很大的损失。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种草莓脱毒育苗方法，其具有脱毒效果好、种苗繁殖快、移栽成活率高以及提高草莓的产量和品质，培育出的草莓脱毒苗具有植株长势强的优点。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种草莓脱毒育苗方法，其包括以下步骤：

s1、外植体的选取：选择长势良好、无病虫害、无畸形的健壮草莓植株，取其匍匐茎带节茎段，选取顶端处有四个未展叶之间的匍匐茎；将选用的外植体置于6℃下的低温状态下保存10-18h；

s2、外植体的消毒灭菌：将步骤s1处理的匍匐茎从低温状态自然升温至室温，从顶部第二个未展叶、第三个未展叶之间剪切6-8cm的匍匐茎，将匍匐茎放置于75％的酒精中浸泡30-40s，然后在利用0.15％-0.2％的升汞溶液处理1min，最后将匍匐茎再次放入75％的酒精中浸泡30-40s，处理后用无菌蒸馏水反复冲洗三次；

s3、外植体的接种培养：将步骤s2处理的外植体接种在茎尖诱导培养基上，在温度为25℃±3℃、湿度为75℃、光强为2000lux、光照时间为14h/d下培养，至六周后其余条件不变光强增强到3000lux，八周后光强减弱至2000lux下继续培养直至从茎尖诱导出再生植株幼芽，此阶段培养2-3个月，完成初代培养；

s4、分化形成脱毒幼苗：将步骤s3处理的植株幼芽切成小块接种在增殖培养基上，在25℃±3℃、湿度为75℃、光强为2000-3000lux、光照时间为14h/d下培养至长成5-8cm长幼苗；

s5、幼苗的驯化及移栽：将步骤s4的幼苗移栽至灭菌处理的营养土中，从人工气候培养箱中拿出放在光照培养架上培养，后再转移至室外遮阳网的环境下生长，此阶段生长2-3周后，移栽到土壤中，定期浇水、施肥处理，并关注植株生长状态。

通过采用上述技术方案，由于采用选用未展叶的匍匐茎作为外植体，其中未展叶的污染率较低，从而得到的种苗脱毒效果好，污染率低；匍匐茎培育繁殖为营养繁殖，从而利用草莓匍匐茎，在消毒灭菌的条件下，放在含有全面营养成分的培养基培养出与原来的匍匐茎基本相同的种苗，且这种繁殖速率快、受环境影响小和脱毒效果优的特点；外植体先后经过酒精、升汞和酒精再次的消毒处理，经过茎尖诱导培养以及在培养过程中采用不同周期的光强照设物质诱导，能够显著提高外植体茎芽的发芽率；植株幼芽切成小块接种到增殖培养基中，能够很好的保存植株幼芽，诱导增殖，在保存植株幼芽的同时，实现植株幼芽数量呈指数增长，提高植株幼芽的繁殖系数，并在特定的温度、湿度、光强条件下诱导切成小块的植株幼芽形成新芽、新根；将诱导的幼苗拿到光照培养架上培养，驯化，后将驯化的幼苗移植到室外遮阳网下生长，生长2-3周，后将生长健壮的幼苗移栽到土壤中，经过连续的炼苗处理，大大提高无菌苗移栽的成活率，同时避免根菌真菌的感染，使得草莓的产量和品质大大提高，培育出的草莓脱毒苗具有植株长势强的优点。

进一步地，所述步骤s1的匍匐茎采集长度为12-16cm。

通过采用上述技术方案，由于未展叶的匍匐茎污染率低，毒性小，同时匍匐茎采集长度为12-16cm，避免外界污染源对外植体的污染，进一步减少外植体的毒性，提高幼苗的脱毒率。

进一步地，所述步骤s2中的升汞溶液中滴加1至3滴的吐温20。

通过采用上述技术方案，由于吐温20是非离子型表面活性剂，降低非特异性的结合，降低外植体表面的张力达到更好的消毒效果，提高外植体表面灭菌的效果，降低幼苗培养的污染率。

进一步地，所述步骤s2与s3中增加步骤s2.1，所述s2.1为将步骤s2处理的匍匐茎放置于超净台上，在解剖镜下由外向内依次剥除外包裹的茎皮，获取生长点，并用解剖针挑取生长点上部组织作为外植体。

通过采用上述技术方案，将匍匐茎放置于超洁净的超净台上，从而在培养过程中进一步降低内生菌对外植体污染，降低生成幼苗的污染率；同时选用生长点，生长点即为草莓匍匐茎的生长锥或分生组织，并且此处的细胞分裂活动旺盛，分化程度低，大大降低植株内部毒性甚至无毒，从而降低植株培育幼苗的周期，降低幼苗的毒性，提高脱毒率。

进一步地，所述外植体的留取长度为0.4mm±0.05mm。

通过采用上述技术方案，外植体选取长度为0.4mm±0.05mm生长点上部组织，提高茎芽的生长速率，进一步缩短幼苗的生长时间，大大提高繁殖速率。

进一步地，所述步骤s2.1增加有步骤s2.2，所述s2.2为步骤s2.1处理得到的外植体放置于抗褐化培养基中浸泡10-15min。

通过采用上述技术方案，有效防止外植体褐变的产生，保证外植体成活达到90％以上。

进一步地，所述抗褐化培养基由15000-25000mg/l的硫代硫酸钠、200-400mg/l维生素c、1-5mg的活性碳、20-30g/l蔗糖和6g/l的琼脂，所述抗褐化培养基的ph值在5.4-5.8之间。

通过采用上述技术方案，由于抗褐化培养基解决了草莓外植体快速繁殖易出现褐化现象，种苗成活率和质量得到了提高。

进一步地，所述抗褐化培养基还添加有1-2g/l的pvp。

通过采用上述技术方案，进一步抑制外植体褐化效果，提高抗褐化率。

进一步地，所述步骤s3中的茎尖诱导培养基是以ms培养基为基本培养基，所述ms培养基中添加ms+6-ba、naa、碳源和凝胶，其中ms+6-ba浓度为0.3mg/l-0.5mg/l，naa浓度为0.05-0.1mg/l，碳源为20-30g/l蔗糖，凝胶浓度为6g/l的琼脂。

通过采用上述技术方案，ms+6-ba为细胞分裂素、naa是萘乙酸为生长素的一种，从而促进外植体生长，有助于根和芽的分化，同时适于植株幼芽的则增至培养，利于愈伤组织的产生，并促进芽的分化；蔗糖为外植体组织提供碳源并调节渗透压；琼脂对茎尖诱导培养基具有支持和固定作用，从而能够显著提高外植体茎芽的发芽率和生根率。

进一步地，所述ms+6-ba浓度优选为0.4mg/l，naa浓度优选为0.08mg/l。

通过采用上述技术方案，进一步提高对外植体茎芽发芽率和生根率，对草莓幼苗增殖作用由显著的效果，提高增殖率。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

第一、由于本发明采用四个未展叶之间的匍匐茎以及幼苗培育条件，从而得到脱毒幼苗，且污染率低的幼苗，提高草莓的产量和品质，培育出的草莓脱毒苗具有植株长势强的效果。

第二、本发明中草莓脱毒育苗方法改良了对外植体匍匐茎尖脱毒的方式，采用匍匐茎第二未展叶、第三未展叶之间的匍匐茎培育植株茎芽剥离脱毒，大大降低污染率以及褐化率，大幅提高了茎尖分生组织的脱毒率和成活率，工作效率有效提高、成本大幅度降低。

第三、本发明的方法，获取的植株茎尖在适宜的温度、湿度、光照条件下保存，即能保持品种的优良性状、遗传稳定性，有效缩短从脱毒到规模生产的周期，同时有效降低了生产成本与劳动成本。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。以下各个实施例的试验时间为2018年至2020年，试验地点为蚌埠海上明珠农业科技发展有限公司。

实施例1

草莓脱毒育苗方法，包括以下操作步骤：

1草莓植株的选择

选择长势良好、无病虫害、无畸形的健壮草莓植株，放入培养室内，每日中16h在36℃、2100lux光照的条件下处理，其余8h在30℃、黑暗条件下培养，持续循环变温处理4周；

2外植体的选取和消毒灭菌

2.1外植体的选取：取步骤(1)培养的草莓植株，选取其匍匐茎带节茎段用洗涤液对匍匐茎表面搓洗3次，再用流水冲洗10min，切取顶端处有四个未展叶之间的匍匐茎，其匍匐茎采集长度为14cm；将选用的匍匐茎置于6℃下的低温状态下保存14h；

2.2外植体的消毒灭菌：将步骤(2.1)处理的匍匐茎从低温状态自然升温至室温，并将该茎段的匍匐茎转移至超净台上，切取从顶部第二个未展叶、第三个未展叶之间7cm的匍匐茎，并将剪切的匍匐茎放置于75％的酒精中浸泡35s，然后猜中质量分数为0.2％的升汞溶液+2滴吐温20的杀菌剂消毒处理1min，其再次将匍匐茎放入75％的酒精中浸泡35s处理，最后将杀毒灭菌处理后的匍匐茎用无菌蒸馏水反复冲洗三次，并用无菌滤纸吸干表面水分；

2.2.1将步骤(2.2)处理的匍匐茎放置于超净台上，在解剖镜下由外向内依次剥除外包裹的茎皮，获取生长点，并用灭过菌的解剖针挑取生长点上部组织作为外植体，且外植体生长点留取长度为0.4mm±0.05mm的小颗粒，该过程处于无菌环境中操作，并将外植体生长点表面的水分沥干；

2.2.2将步骤(2.2.1)处理的外植体生长点放置于抗褐化培养基中浸泡12min，然乎取出外植体生长点并用无菌蒸馏水反复冲洗三次，后无菌滤纸吸干表面水分；其中抗褐化培养基由浓度为20000mg/l的硫代硫酸钠、300mg/l维生素c、3mg的活性碳、30g/l蔗糖、6g/l的琼脂和1.5g/l的pvp，抗褐化培养基的ph值在5.4-5.8之间；

3外植体的接种培养

将步骤(2.2.2)抗褐化处理后外植体生长点接种至茎尖诱导培养基上，在温度为25℃±3℃、湿度为75℃、光强为2000lux、光照时间为14h/d下培养，至六周后其余条件不变光强增强到3000lux，八周后光强减弱至2000lux下继续培养直至从茎尖诱导出再生植株幼芽，此阶段培养2-3个月，完成初代培养；其中茎尖诱导培养基以ms培养基为基本培养基，ms培养基中添加ms+6-ba、naa、碳源和凝胶，其中ms+6-ba浓度为0.4mg/l，naa浓度为0.08mg/l，碳源为30g/l蔗糖，凝胶浓度为6g/l的琼脂，茎尖诱导培养基的ph值在5.4-5.8之间；4分化形成脱毒幼苗

将步骤(3)茎尖诱导培养基处理后得到的植株幼芽用无菌蒸馏水反复冲洗三次，后无菌滤纸吸干表面水分；将其处理的植株幼芽放置于超净台上切成小块，并将切除的小块接种至增殖培养基中，培养温度为25℃±3℃、湿度为75℃、光强为2500lux、光照时间为14h/d下培养至长成5-8cm长幼苗；其中增殖培养基为msm基本培养基为基础培养基，ms培养基中添加0.5mg/l6-ba，200mg/l谷氨酰胺，30g/l蔗糖和6g/l琼脂，增殖培养基的ph值在5.4-5.8之间；

5幼苗的驯化及移栽

将步骤(4)处理得到的长幼苗移栽至灭菌处理的营养土中，从人工气候培养箱中拿出放在光照培养架上培养，后再转移至室外遮阳网的环境下生长，此阶段生长3周后，移栽到土壤中，定期浇水、施肥处理，并关注植株生长状态。

实施例2

操作方法同实施例1，其中取消步骤(2.2.1)中剥除匍匐茎外包裹茎皮，获取生长点上部组织的方案。

实施例3

操作方法同实施例1，其中取消步骤(2.2.2)中抗褐化培养基的方案。

实施例4

操作方法同实施例1，其中将步骤(2.2.2)中抗褐化培养基中的1.5g/l的pvp改为等量20000mg/l的硫代硫酸钠。

对照例1

操作方法同实施例1，其中将步骤(2)中(2.1)外植体的选取和(2.2)外植体的消毒灭菌的方法改为以下方法：

2.1外植体的选取：取步骤(1)培养的草莓植株，选取其匍匐茎带节茎段用洗涤液对匍匐茎表面搓洗3次，再用流水冲洗10min，切取顶端处有四个展叶之间的匍匐茎，其匍匐茎采集长度为14cm；将选用的匍匐茎置于6℃下的低温状态下保存14h；

2.2外植体的消毒灭菌：将步骤(2.1)处理的匍匐茎从低温状态自然升温至室温，并将该茎段的匍匐茎转移至超净台上，切取从顶部第二个展叶、第三个展叶之间7cm的匍匐茎，并将剪切的匍匐茎放置于75％的酒精中浸泡35s，然后猜中质量分数为0.2％的升汞溶液+2滴吐温20的杀菌剂消毒处理1min，其再次将匍匐茎放入75％的酒精中浸泡35s处理，最后将杀毒灭菌处理后的匍匐茎用无菌蒸馏水反复冲洗三次，并用无菌滤纸吸干表面水分。

对照例2

操作方法同实施例1，其中将步骤(2)中(2.1)外植体的选取和(2.2)外植体的消毒灭菌的方法改为以下方法：

2.1外植体的选取：取步骤(1)培养的草莓植株，选取其匍匐茎带节茎段用洗涤液对匍匐茎表面搓洗3次，再用流水冲洗10min，切取顶端处的匍匐茎，其匍匐茎采集长度为14cm；将选用的匍匐茎置于6℃下的低温状态下保存14h；

2.2外植体的消毒灭菌：将步骤(2.1)处理的匍匐茎从低温状态自然升温至室温，并将该茎段的匍匐茎转移至超净台上，切取从顶部开始计算切取7cm的匍匐茎，并将剪切的匍匐茎放置于75％的酒精中浸泡35s，然后猜中质量分数为0.2％的升汞溶液+2滴吐温20的杀菌剂消毒处理1min，其再次将匍匐茎放入75％的酒精中浸泡35s处理，最后将杀毒灭菌处理后的匍匐茎用无菌蒸馏水反复冲洗三次，并用无菌滤纸吸干表面水分。

对照例3

操作方法同实施例1，其中将步骤(3)外植体的接种培养方法改为以下方法：

3外植体的接种培养

将步骤(2.2.2)抗褐化处理后外植体生长点接种至茎尖诱导培养基上，在温度为25℃±3℃、湿度为75℃、光强为3000lux、光照时间为14h/d下培养，此阶段培养5-6个月，使得茎尖诱导出再生植株幼芽，此完成初代培养；其中茎尖诱导培养基以ms培养基为基本培养基，ms培养基中添加ms+6-ba、naa、碳源和凝胶，其中ms+6-ba浓度为0.4mg/l，naa浓度为0.08mg/l，碳源为30g/l蔗糖，凝胶浓度为6g/l的琼脂，茎尖诱导培养基的ph值在5.4-5.8之间。

试验结果统计：

脱毒效果的比较：每组取70个外植体样本，分别采用实施例1-4方法进行操作，在培养过程中统计茎尖接种成活率，污染率，获得脱毒种苗后进行病毒检测统计脱毒率，移栽成活率，移栽后的主茎高度和植株生长态势。

脱毒率根据《脱毒草莓种苗病毒检测技术规程》的指示植物检测法对本发明各实施例和对照例的外植体组培苗进行检测，得出外植体组培苗是否脱毒，并计算脱毒率。

表1脱毒效果比较

由表1数据可以看出，采用本发明的脱毒方法，将选取无展叶的匍匐茎、低温处理脱毒法、茎尖脱毒、抗褐化培养、不同时间段光强照射、茎尖诱导培养基和增殖培养基的多种方式的结合，对草莓脱毒育苗的组织培养、快速繁殖具有良好的去病毒作用，获得的草莓脱毒苗茎病毒检测，脱毒率高达99.8％，且后期的种植过程，移栽成活率高，污染率低，可以直接移栽，不需要炼苗，繁殖速度快，从而提高草莓的产量和配制，培育出的草莓脱毒苗生长态势优良的特点。

根据实施例1的草莓脱毒育苗方法，蚌埠海上明珠农业科技发展有限公司采用之后，培育出优质的草莓；毒育苗并取得突破性的进步，实现大规模工厂化生产，目前优质的的草莓脱毒育苗年产量达到了4000万株以上。本发明草莓脱毒育苗方法而获得的脱毒幼苗和常规苗相比有明显的生长优势及增产效果。不同品种的草莓脱毒苗，比常株苗，植株株高增加34％，叶面积增大65％左右，匍匐茎数量增多93％左右，提高了植株的产量和质量，其中增加产量达50％-60％。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。