本发明涉及包含益生菌生物体的食品，并涉及生产待掺入多种食品的健壮的益生菌细胞的方法。

背景技术：

在被制造为掺入活益生菌细菌的食品中，某些食品中的活益生菌细胞在产品预期的货架寿命结束时通常会大量减少(例如，减少一个对数或更多)。目前对这种减少的一种解决方案涉及，当生产掺入有益生菌的食品时，将过量益生菌掺入产品中，以在食品的货架寿命内使剩余的活益生菌细菌的量最大化。仍然需要更健壮的益生菌细胞或在多种食品中使益生菌细胞健壮的方法，从而可以最大程度地避免益生菌过量。

技术实现要素：

以下是本公开的简化概要，旨在提供对本文所描述的方法和产品的基本理解。这不是详尽的概述，也不旨在标识关键或重要要素或描述本说明书的范围。它的唯一目的是以简化的形式提出一些概念，作为下文更详细描述的序言。

一种生产健壮的益生菌细胞的示例性方法包括以下步骤：将解冻的益生菌细胞引入预调理环境中，该预调理环境包含足够的营养物以制备用于掺入目标食品中的解冻的益生菌细胞；以及为解冻的益生菌细胞提供至少2小时的孵育期，从而产生接种预处理的益生菌细胞。在一些实施方式中，孵育期包括最多1个完整的益生菌细胞分裂周期。在一些实施方式中，在引入步骤之前，该方法包括解冻冷冻的益生菌细胞的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步包括在孵育期之后，将预处理的益生菌细胞添加到目标食品中以生产包含健壮的益生菌补充剂的食品的步骤。可选地，处理和预调理步骤与目标食品(即食物或饮料产品)的生产同时进行，益生菌细菌被添加到该目标食品中。可以将接种的益生菌细胞与任意数量的水果、蔬菜和/或乳制品一起掺入。在一些实施方式中，食品包含低ph基质，该低ph基质可以具有小于约4.5的ph。在以下的书写的详细描述和附图中，本发明的其他方面、实施方式和特征将变得明显。

附图说明

所附权利要求中陈述了被认为是本发明的特色的新颖特征。然而，在结合附图阅读时，参照以下说明性实施方式的详细描述，将最好地理解本发明本身及其优选的使用方式、其他目的和优势。

图1描绘了本文所描述的方法的一种实施方式的流程图。

图2描绘了低ph食品环境对益生菌细胞的毒性和本文所描述的方法的细胞过程的解毒机理的示意图。

图3描绘了比较三个样品的条形图，其中比较了益生菌细胞的活力，在这三个样品中，益生菌通过未预调理直接接种、在4℃下预调理2小时以及在4℃下预调理4小时而被引入饮料中。

具体实施方式

当前可获得的益生菌是在对于后续的需要进行使用之前通过冷冻或冷冻干燥进行的存储而言理想的条件下生产的。这样的条件与益生菌细菌被掺入其中的一些食品基质的条件有很大不同。举例来说，新鲜解冻的益生菌细菌并非是准备在货架寿命存活于果汁，例如橙汁中存在的酸性条件，其包括约为4的ph水平，有氧环境，会对益生菌活力不利的化合物，以及可能不富含适合益生菌生存的氨基酸或蛋白质的营养物水平。例如，植物化学物质(例如多酚)会不利地影响益生菌活力。从冷冻状态解冻的益生菌细菌细胞可能缺乏处理基于水果的饮料的低ph环境的结构和酶系统，包括细胞膜上的质子泵(f0f1-atp酶)和细胞缓冲系统。因此，食品中的益生菌细胞的货架寿命会显著降低。

在如此迥然不同的饮料产品条件下，在将活益生菌细菌细胞掺入酸性饮料(例如基于水果的饮料)后72天的期间里，活益生菌细菌细胞的减少通常大于约95％。基于水果的饮料中益生菌存活率低的根本原因是，益生菌细菌细胞是在被设计成在储存后使其产量和活力最大化的条件下生产的。也就是说，益生菌细胞被设计成最大程度地从冷冻-解冻循环的损伤中恢复。然而，这些条件未被设计成允许益生菌细胞适应于存活在某些食品的产品基质中以及某些食品的生产条件下，所述某些食品包括包含低ph的基于水果的饮料。对于益生菌细胞来说，没有时间和营养支持来适应其预定的/最终的食品基质。例如，包含少量氨基酸或蛋白质的基于水果的饮料不能为益生菌细菌提供足够的营养以产生使细胞能够在恶劣的低ph环境下生存的大量需要的质子泵、细胞缓冲系统和用于解毒氧气的酶。

细菌生长周期分为四个阶段：延滞期、对数期、稳定期和死亡期。在延滞期，细菌细胞复制各种蛋白质并合成rna以为对数期做准备，在对数期期间，细菌菌落的尺寸急剧增加。在对数期之后，稳定期涉及细胞和菌落生长的减慢。随着资源被利用，细胞死亡的速率开始与细胞分裂的速率相一致。由于资源有限、废物的产生或其他的环境变化而导致条件衰退时，菌落进入了最后的死亡期。

通过关注延滞期的条件和生理学，提出了处理益生菌以允许适应其中最终掺入益生菌的食物基质的某些生长条件。通过为细菌提供允许其培养基稳定在适当平衡的组分，与某些食物基质的相互作用的改善将导致益生菌的货架寿命的改善。图1是示出了用于增加巴氏灭菌的产品基质0108中的益生菌活力的方法的一种实施方式的流程图。

在一种实施方式中，通过掺入营养加工助剂(例如碳水化合物和氨基酸)并为益生菌细胞建立细胞酶系统设置适当的条件，将经处理的益生菌细胞设置为在低ph下存活。用于形成稳定或健壮的益生菌细胞的方法包括提供冷冻的益生菌细胞0102。冷冻的益生菌细胞0102可以储存在-80℃的冰箱中。在一些实施方式中，该方法包括解冻0104冷冻的益生菌细胞。例如，可以将冷冻的益生菌细胞0102放置在0到39℃的温度的储存环境中。在一些实施方式中，该方法包括将解冻的益生菌细胞引入预调理环境0106，该预调理环境0106包含足够的营养物以制备用于掺入巴氏消毒的食品中的解冻的益生菌细胞；以及以至少2小时的孵育期预调理解冻的益生菌细胞，以产生接种预处理的益生菌细胞。在一些实施方式中，该方法可以包括解冻冷冻的益生菌细胞，然后将解冻的益生菌细胞引入预调理环境中。在一些实施方式中，该方法可以包括在解冻冷冻的益生菌细胞的同时将解冻的益生菌细胞引入预调理环境中。例如，解冻和引入的组合步骤可以进行约2小时到24小时。预调理环境的条件可以使益生菌细胞从制造的冷冻的益生菌细胞的冷冻-解冻损伤中恢复。在一些实施方式中，将预调理的益生菌细胞引入巴氏灭菌的产品基质0108中以提供包含益生菌细胞的食品。如本文所用，“巴氏灭菌的产品基质”可以是半固体或液体形式(例如，零食或饮料)。如本文所用，“食品”包含巴氏灭菌的产品基质和预调理的益生菌细胞。在一些实施方式中，该方法包括将食品包装0110在无菌容器中。

在一些实施方式中，为了获得健壮的益生菌细胞，足够的营养物包括碳水化合物和氨基酸中的一种或多种。在一些实施方式中，营养物包括碳水化合物，例如乳糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖及其组合。在一些实施方式中，营养物包括天然存在于汁液中的其他简单糖或寡糖。例如，汁液、浓缩物、泥、甘露(nectar)和其他制剂可以源自诸如苹果、橙子、梨、芒果、石榴、西瓜、菠萝、桃子、葡萄、猕猴桃、椰子和柠檬的水果的任一种或组合。在一些实施方式中，营养物包括碳水化合物，例如，源自诸如小麦草、黄瓜、生菜、南瓜和冬瓜的蔬菜的汁液或泥。在一些实施方式中，营养物包括一种或多种氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸包括高半胱氨酸。在一些实施方式中，氨基酸包括胱硫醚。在一些实施方式中，氨基酸包括半胱氨酸。在一些实施方式中，氨基酸包括高半胱氨酸、胱硫醚、半胱氨酸或其任何组合或子组合。其他合适的氨基酸包括但不限于丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或其组合或子组合。不受任何特定理论的束缚，据信氨基酸使益生菌细胞产生质子泵并发展出细胞缓冲液(cellularbuffer)以应付食品的低ph条件，所述食品中将添加益生菌以生产具有健壮的益生菌补充剂的食品。

除了碳水化合物和氨基酸外，有机酸也可以存在于合适的预调理环境中。有机酸的一些实例可以包括但不限于柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、甲酸和乳酸或其组合或子组合。

除了用于在期望的食品基质环境中的成功繁殖的充足的均衡营养物之外，该方法包括为解冻的益生菌细胞提供约2小时至最多益生菌细胞完成一个细胞分裂周期所用的时间的孵育期。在一些实施方式中，细胞分裂周期可以包括最多约24小时。在一些实施方式中，细胞分裂周期可以为约6小时至16小时。细胞分裂周期时间取决于许多不同的因素，包括例如益生菌细胞的环境、预调理流体的质量和益生菌细胞的类型。孵育期应允许并诱导益生菌细胞产生质子泵并发展出细胞缓冲液，该细胞缓冲液是应对食品所需要的，更具体地说是应对待添加预处理的益生菌细胞的目标食品或期望食品的环境所需要的。不希望受任何特定理论的束缚，据信延长超过细胞分裂周期的孵育期可导致产品的感官属性和营养价值偏离期望的产品规范。例如，细胞分裂过程可包括环境中营养物质的进一步代谢，从而导致产品的营养价值和感官特征发生变化。

在预调理环境内的处理还可包括合适的温度以允许益生菌细胞适应期望的食品基质。在一些实施方式中，预调理环境包括约0℃至39℃的温度。在一些实施方式中，预调理环境包括约4℃至10℃的温度。在其他实施方式中，可以选择一个或多个温度以平衡温热细胞的能量成本并优化解冻所用的时间。在一些实施方式中，解冻所用的时间为约1至16小时。在一些实施方式中，解冻所用的时间为8至16小时。在一些实施方式中，解冻所用的时间为约4至8小时。解冻所用的时间可以基于解冻益生菌所使用的温度而变化。

在一些实施方式中，图1所示的过程0101可以与水果饮料或其他食品的掺混和巴氏灭菌过程并行地执行。图2描绘了水果饮料的低ph环境对益生菌细胞的毒性、质子泵的解毒机理以及处理本文所述的益生菌细胞的潜在的关键细胞过程的示意图。在细胞外部，水果饮料样品的ph值为4。低的外部ph促使很大一部分有机酸为中性形式。这种有机酸的中性形式扩散到细胞中。在细胞内部，高的内部ph值(ph6.5)促使很大一部分有机酸解离形成h+和有机酸阴离子。h+对细胞有毒。通过提供碳水化合物形式的能量、氨基酸形式的构成要素、合适的温度和使细胞合成更多质子泵的时间(图2的右侧)，细胞可以更好地适应低ph值，然后更好地装备起来以通过将多余的质子泵出来应对多余的质子。

在一些实施方式中，食品包括果汁饮料、碳酸饮料、发酵饮料、强化水、水果思慕雪、蔬菜汁、乳制品思慕雪、乳制品饮料、能量饮料、袋装饮料(sachet)、小份饮料(shot)或酸奶产品。“小份饮料”是指体积为约4盎司或更少的液体产品配方。在一些实施方式中，食品是“零食食品”，其是指不需要进一步烹饪的即食食品。在一些实施方式中，生产的零食需要冷藏。应当理解，根据本公开的食品可以具有许多不同的具体配方或组分中的任何一种。

在一些实施方式中，食品是饮料。饮料包括例如汁液饮料(例如包含一种或多种果汁和/或一种或多种蔬菜汁的饮料)、补水饮料(例如添加了电解质的补水饮料)、冷冻或冷藏饮料、咖啡因饮料、碳酸饮料、非碳酸饮料、诸如膳食饮料或其他减卡路里的饮料的零卡路里至低卡路里的饮料(例如，0-150大卡和最多10克糖/12盎司(oz.))、以及糖浆或浓缩物。合适的含乳制品的饮料的非限制性实例包括乳汁(例如2％的乳汁)和其他含乳汁的饮料(例如含乳汁的咖啡饮品)。其他合适的含乳制品的饮料包括本领域已知的任何饮料。在一些实施方式中，食品是可能需要冷藏的饮料。在一些实施方式中，食品是在不需要冷藏的环境条件下稳定且安全地储存的饮料。在一些实施方式中，食品具有低于约4.5的低ph。合适的饮料可包含甜味剂、水、乳制品、咖啡因、碳酸、果汁、蔬菜汁、食品级酸或其混合物。本文公开的饮料产品包括即饮液体配方(即，即饮饮料)、饮料浓缩物、饮料胶囊(pod)等。术语“即饮”是指配制为按原样摄取的饮料。因此，在一些实施方式中，即饮饮料在被消费者摄取之前不需要稀释或添加。应当理解，根据本公开的饮料和饮料浓缩物可以具有许多不同的具体配方或构成中的任何一种。

实施例

将750g袋装益生菌保存在-80℃的冰箱中直至准备使用。然后从冰箱中取出样品，并在温度为4℃的储存环境中放置16小时解冻。将解冻的益生菌与在混合前冷却至4℃的巴氏杀菌的单倍浓度(singlestrength)苹果汁混合。益生菌苹果汁混合物具有约9.7×1010cfu/ml(菌落形成单位(cfu)每毫升(ml))的活益生菌细胞(对于开始的浓缩储备液，比例约为1:1)。在一个实施例中将混合物在4℃下预调理2小时后，或者在另一实施例中将混合物在4℃下预调理4小时后，将益生菌细胞接种到32盎司(946ml)的草莓香蕉汁基底中以达到约108cfu/ml活益生菌细胞。作为对照，将草莓香蕉汁基底的另一个样品与相同量的未预调理的益生菌细胞混合。对于对照样品，将与含有预调理的混合物的接种样品相同的水平(例如，约108cfu/ml活益生菌细胞)的量的未预调理的益生菌细胞添加到草莓香蕉汁基底中。接种后，将两个实施例和一个对照样品的益生菌草莓香蕉汁储存在4℃下。接种后立即测量接种后果汁中的活益生菌细胞的量，然后在4℃下储存2天、14天、30天、42天、65天和72天后再进行测量。

图3显示了每个时间间隔内活益生菌的平均logcfu/ml测量值。在所有三个样品中，在65天的期间里活益生菌细胞的损耗率逐渐变化。然而，在未预调理的对照样品中所见的损耗率大于预调理的样品。例如，在65天后，所剩的菌落形成单位占预调理的样品中的初始cfu的百分比是未预调理的对照样品中所剩cfu的百分比的两倍。预调理样品的结果表明，可以减少引入基底中的益生菌细胞的初始量，以实现满足在货架寿命日期之前在8盎司产品(236ml)中提供10亿cfu益生菌细胞的要求的产品。

另外的实施方式

提供以下描述性实施方式作为对所公开发明的进一步支持：

在第一实施方式中，本公开中所描述的新颖方面涉及形成稳定的益生菌细胞的方法，该方法包括：将解冻的益生菌细胞引入预调理环境中，该预调理环境包含足够的营养物以制备用于掺入食品中的解冻的益生菌细胞；以及将解冻的益生菌细胞在预调理环境中预调理至少约2小时，从而产生预调理的益生菌细胞。

在第一实施方式的另一方面中，形成稳定的益生菌细胞的方法包括：将解冻的益生菌细胞引入预调理环境中，该预调理环境包含足够的营养物以制备用于掺入食品中的解冻的益生菌细胞；将解冻的益生菌细胞在预调理环境中预调理至少约2小时，从而产生预调理的益生菌细胞；并进一步包括选自以下限制中的一个或多个：

其中预调理环境包含苹果汁；

其中预调理环境包含流体，并且其中该流体和益生菌细胞掺混以达到预定的益生菌浓度；

其中预定的益生菌浓度为约1.0×1010cfu/ml至1.0×1011cfu/ml；

其中预调理环境包括约0℃至约39℃的温度；

其中预调理环境包括约0℃至约10℃的温度；

其中孵育期小于一个完整的细胞分裂周期；

其中至少一个完整的细胞分裂周期小于24小时；

在引入步骤之前，解冻冷冻的益生菌细胞；

在约0℃至39℃的温度下解冻冷冻的益生菌细胞；

将冷冻的益生菌细胞解冻至少8小时；

在提供步骤之后，将预处理的益生菌细胞添加到巴氏灭菌的产品基质中以生产包含稳定的益生菌细胞的食品；

其中营养物包括碳水化合物；

其中营养物包括氨基酸；

其中氨基酸包括高半胱氨酸、胱硫醚、半胱氨酸或其组合。

在第二实施方式中，本公开的新颖方面涉及用于掺入巴氏灭菌的产品基质中以提供食品的预调理的益生菌掺混物，该预调理益生菌掺混物包含：预定量的解冻的益生菌细胞；预调理流体，其中预调理流体包含营养物；和约1.0×1010cfu/ml至约1.0×1011cfu/ml的益生菌浓度。

在第二实施方式的另一方面中，本公开的新颖方面涉及用于掺入巴氏灭菌的产品基质中以提供食品的预调理的益生菌掺混物，该预调理的益生菌掺混物包含：预定量的解冻的益生菌细胞；预调理流体，其中预调理流体包含营养物；和约1.0×1010cfu/ml至约1.0×1011cfu/ml的益生菌浓度，该用于掺入巴氏灭菌的产品基质中以提供食品的预调理的益生菌掺混物还包括选自以下限制中的一个或多个：

其中巴氏灭菌的产品基质具有低于约7.0的ph；

其中巴氏灭菌的产品基质具有约4.0至约5.0的ph；

其中巴氏灭菌的产品基质具有第一ph，并且所述预调理的益生菌掺混物具有第二ph，其中第一ph与第二ph相差1.0ph或更小；

其中食品是零食食品；

其中食品是饮料；

其中饮料包含乳制品；

其中饮料包含水果；

其中饮料包含蔬菜；

其中饮料包含咖啡因；

其中饮料包含碳酸化作用；

其中每8盎司(236ml)份的饮料提供至少10亿个cfu的益生菌细胞；

其中饮料提供约1.6×108cfu/ml至约2.6×108cfu/ml的活益生菌；

其中营养物包括碳水化合物；

其中营养物包括氨基酸；

其中营养物包括有机酸；

其中预调理流体源自蔬菜；以及

其中预调理流体是源自水果的汁液；

在本发明的另一方面，食品(例如饮料)包含预调理的活益生菌掺混物，该预调理的活益生菌掺混物包含上述特征的任何组合或子组合。

本文使用的词语和短语应该被理解和解释为具有与相关领域的技术人员对那些词语和短语的理解相一致的含义。术语或短语的特殊定义，即与本领域技术人员所理解的普通和惯常含义不同的定义，并不旨在通过本文中术语或短语的一致用法来暗示。在某种意义上，术语或短语旨在具有特殊含义，即不同于本领域技术人员所理解的含义，在说明书中明确地以直接且明确地为术语或短语提供特殊定义的定义方式阐明了这样的特殊定义。

除非另外明确指出，否则术语“包括/包含(including/comprising)”，“具有(having)”及其变体表示“包括但不限于”。当在所附权利要求中以原始和修改的形式使用时，术语“包括”意图是包含性的或开放式的，并且不排除任何另外的未列举的元素、方法、步骤或材料。术语“由...组成(consistingof)”排除权利要求中所指定的那些以外的任何元素、步骤或材料。如本文所用，“最多(upto)”包括零，意味着在一些实施方式中不添加任何量(即0％)。

除非在本文中特别阐述，否则除非另有说明，术语“一种/一个(a/an)”和“该(the)”不限于一个这样的元素，而是表示“至少一个”。如本文所用，术语“约”是指所指示的精确值以及统计变化或测量误差内的值。

本文公开的方法可以在不存在本文未具体公开的任何元素、限制或步骤的情况下适当地实践。类似地，本文描述的具体产品实施方式可在不存在本文未具体描述的任何组分的情况下获得。因此，本文描述的产品可以包含如上所述的那些列出的组分。

可以在本文中以范围格式表示或呈现浓度、量和其他数值数据。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且因此应该被灵活地解释为不仅包括明确列举为范围极限的数值，而且包括在该范围内涵盖的所有单个数值或子范围，就好像明确列举了每个数值和子范围一样。例如，范围1到10还并入了对该范围内的所有有理数的引用(即1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及任何该范围内的有理数范围(例如2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)，因此，在此明确公开了本文明确公开的所有范围的所有子范围。这些仅是具体意图的示例，并且应认为以类似的方式在在本申请中明确地陈述了在所列举的最小值和最大值之间的数值的所有可能的组合。

尽管已经参考若干实施方式具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在形式和细节上进行各种改变。发明人预期熟练的技术人员会适当地采用这样的变型，并且发明人意在以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素在其所有可能的变化中的任何组合。