本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种合生元的制备方法。

背景技术：

合生元（synbiotics）是指益生菌（probiotics）和益生元（prebiotics，主要是各种膳食纤维和低聚糖）的混合制剂。益生菌是指对人体有益作用的且能够改善人体微生态的菌群，常见的肠道益生菌包括双歧杆菌、乳杆菌等。益生菌和益生元的联合使用可以使两者功能相互促进，简而言之，益生元是发酵培养基，提供益生菌富集和生长，而益生菌的生长代谢产物既给肠道提供营养和能量来源，又生产多种b族维生素和短链脂肪酸，促进肠道屏障功能的健康发展。

低聚半乳糖（galactooligosaccharides，gos）具有低甜度、低热量、低致龋齿性、热酸稳定及食品安全性等特殊的性质，是人体肠道中双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌等有益菌极好的营养源和有效的增殖因子，是常见的益生元之一。它可以改善人体肠道的消化吸收功能，常作为一种新型的功能性食品添加剂，被称为食疗效果最好的“双歧因子”。在自然界中，动物的乳汁中存在微量的gos，而人母乳中含量较多，婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的gos成分。

目前，低聚半乳糖的工业化生产效率还较低，副产物较多，产品纯度不高，产率较低。已有专利文献报道江波等人利用费式志贺菌产的β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖，产率可提高到44.5%，仍然有提升空间。正因为现阶段低聚半乳糖的生产效率低下，市场上现有合生元产品中的益生元，大多采用低聚果糖、低聚乳果糖或乳糖醇等，而对低聚半乳糖的利用还不充分。

目前，合生元产品的制备方法仍以益生元原料和益生菌原料的简单复配混合为主，并没有利用到益生菌的发酵特性，没有把益生元的生产和益生菌的活化整合为一个有机的整体。

此外，合生元产品中的益生菌需要经受消化道环境，特别是胃部强酸环境的考验，只有活菌到达肠道，益生菌才能发挥作用。因此，提高合生元产品中益生菌活菌到达肠道的比率，是发挥合生元产品益生作用的关键。

因此，亟需一种既能提高低聚半乳糖产率，又能提高益生菌的存活率，且使其益生菌活菌到达肠道发挥益生作用的合生元的制备方法。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种既能提高低聚半乳糖产率，又能提高益生菌的存活率，且使其益生菌活菌到达肠道发挥益生作用的合生元的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种合生元的制备方法，包括如下步骤：

s1.向质量百分比为30~40wt%的乳糖溶液中加入混合酶，搅拌反应18~36h，得到反应液；

s2.向得到的反应液中加入益生菌进行发酵，得到发酵液；

s3.将得到的发酵液进行多级串联膜浓缩得到浓缩液；

s4.将浓缩液滴入纳米载体溶液中进行包埋，得到包埋溶液，该包埋溶液经冷冻喷雾干燥，

即得合生元产品。

其中，步骤s1中，所述混合酶为β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶的混合物；且质量比为10：1~50：1，优选为20：1~40：1；更优选为30：1。

其中，步骤s1中，所述搅拌反应的工艺条件为：ph5.5~7，温度30~50℃，转速为200~300rpm。

其中，步骤s2中，所述益生菌选自乳双歧杆菌bl-04、鼠李糖乳杆菌lr-32、副干酪乳杆菌lpc-37、干酪乳杆菌lc-11、婴儿双歧杆菌bi-26、长双歧杆菌bl-05中的一种或几种，活菌量为100×108cfu/g，添加量为1~3g/l反应液；（相当于添加后，反应液中初始的益生菌量为1~3×1010cfu/l）

其中，步骤s2中，所述发酵的具体工艺条件：发酵温度为35~40℃，发酵时间为6~12h，所得发酵液中益生菌活菌量为1~3×1011cfu/l。（发酵后，发酵液中的益生菌量提升10倍）

其中，步骤s3中，所述多级串联膜浓缩为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜的串联使用。

其中，步骤s4中，所述纳米载体溶液中的载体选自乳清浓缩蛋白、大豆卵磷脂、明胶、壳聚糖中的一种或几种；所述包埋工艺中的包埋温度为20~25℃。

其中，步骤s4中，所述冷冻喷雾干燥的具体工艺条件：加料速率为31~35ml/min，冷冻喷雾干燥温度为-40~-30℃。

其中，步骤s4中，所述合生元中低聚半乳糖的产率≥60%。

其中，步骤s4中，所述合生元中益生菌的存活率≥90%，合生元的体外模拟消化率≤3.0%。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

（1）本发明合生元的制备方法，通过采用特定复配比的β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶的混合酶进行酶解，然后直接加入特定的益生菌，制备得到的合生元，既能提高低聚半乳糖产率，又能促进益生菌增殖，提高益生菌存活率。

（2）本发明提出一种“一锅式”合生元制备方法，该制备工艺高效、高产、绿色、健康，准确可靠，重复性好，且易于实现工业化生产。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

本发明的实施例及对比例采用的原料均市购即得。

体外模拟消化：

每种合生元样品将先后通过包括口腔和胃相的体外模拟消化模型。口腔相：将0.03g/ml粘蛋白模拟唾液流体预热至37℃后与初始合生元样品混合。调节ph至6.8，在摇床上100rpm转速下处理10min，模拟口腔消化。胃相：在37℃水浴条件下将口腔消化产生的样品与含有0.0032g/ml胃蛋白酶模拟液进行混合。将ph调节至2.5并将样品在摇床上100rpm转速下处理2h，模拟胃液消化。经过口腔、胃相模拟消化后合生元样品体外模拟消化率计算公式如下：

。

实施例1：

一种合生元的制备方法，包括如下步骤：

s1.向质量百分比为35wt%的乳糖溶液中加入复配质量比为30：1的β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶的混合酶，在ph6.5，温度40℃，转速为250rpm条件下搅拌反应27h，得到反应液；

s2.向得到的反应液中加入乳双歧杆菌bl-04、鼠李糖乳杆菌lr-32、副干酪乳杆菌lpc-37、干酪乳杆菌lc-11、婴儿双歧杆菌bi-26和长双歧杆菌bl-05组成的复合益生菌，活菌总量为100×108cfu/g，添加量为3g/l反应液进行发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为9h，得到发酵液；

s3.将得到的发酵液依次通过微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜组合的串联膜浓缩得到浓缩液；

s4.将浓缩液滴入纳米乳清浓缩蛋白溶液中，在温度为20-25℃下涡旋振荡进行包埋，得到包埋溶液，该包埋溶液以33ml/min的加料速度在-40℃进行冷冻喷雾干燥，即得合生元。

所得合生元中低聚半乳糖的产率、益生菌的存活率、体外消化率等性能指标的结果如表1所示。

实施例2：

一种合生元的制备方法，包括如下步骤：

s1.向质量百分比为35wt%的乳糖溶液中加入复配质量比为20：1的β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶的混合酶，在ph5.5，温度50℃，转速为200rpm条件下搅拌反应18h，得到反应液；

s2.向得到的反应液中加入乳双歧杆菌bl-04、鼠李糖乳杆菌lr-32、副干酪乳杆菌lpc-37、婴儿双歧杆菌bi-26和长双歧杆菌bl-05组成的复合益生菌，活菌总量为100×108cfu/g，添加量为2g/l反应液进行发酵，发酵温度为35℃，发酵时间为12h，得到发酵液；

s3.将得到的发酵液依次通过微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜组合的串联膜浓缩得到浓缩液；

s4.将浓缩液滴入纳米大豆卵磷脂溶液中，在温度为20-25℃下涡旋振荡进行包埋，得到包埋溶液，该包埋溶液以31ml/min的加料速度在-30℃进行冷冻喷雾干燥，即得合生元。

所得合生元中低聚半乳糖的产率、益生菌的存活率、体外消化率等性能指标的结果如表1所示。

实施例3：

一种合生元的制备方法，包括如下步骤：

s1.向质量百分比为35wt%的乳糖溶液中加入复配质量比为40：1的β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶的混合酶，在ph7.0，温度30℃，转速为300rpm条件下搅拌反应36h，得到反应液；

s2.向得到的反应液中加入乳双歧杆菌bl-04、鼠李糖乳杆菌lr-32、婴儿双歧杆菌bi-26和长双歧杆菌bl-05组成的复合益生菌，活菌总量为100×108cfu/g，添加量为1g/l反应液进行发酵，发酵温度为40℃，发酵时间为6h，得到发酵液；

s3.将得到的发酵液依次通过微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜组合的串联膜浓缩得到浓缩液；

s4.将浓缩液滴入纳米明胶溶液中，在温度为20-25℃下涡旋振荡进行包埋，得到包埋溶液，该包埋溶液以35ml/min的加料速度在-35℃进行冷冻喷雾干燥，即得合生元。

所得合生元中低聚半乳糖的产率、益生菌的存活率、体外消化率等性能指标的结果如表1所示。

实施例4：

一种合生元的制备方法，包括如下步骤：

s1.向质量百分比为35wt%的乳糖溶液中加入复配质量比为10：1的β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶的混合酶，在ph6.5，温度40℃，转速为250rpm条件下搅拌反应27h，得到反应液；

s2.向得到的反应液中加入乳双歧杆菌bl-04、婴儿双歧杆菌bi-26和长双歧杆菌bl-05组成的复合益生菌，活菌总量为100×108cfu/g，添加量为3g/l反应液进行发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为9h，得到发酵液；

s3.将得到的发酵液依次通过微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜组合的串联膜浓缩得到浓缩液；

s4.将浓缩液滴入纳米壳聚糖溶液中，在温度为20-25℃下涡旋振荡进行包埋，得到包埋溶液，该包埋溶液以33ml/min的加料速度在-40℃进行冷冻喷雾干燥，即得合生元。

所得合生元中低聚半乳糖的产率、益生菌的存活率、体外消化率等性能指标的结果如表1所示。

实施例5：

一种合生元的制备方法，包括如下步骤：

s1.向质量百分比为35wt%的乳糖溶液中加入复配质量比为50：1的β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶的混合酶，在ph6.5，温度40℃，转速为250rpm条件下搅拌反应27h，得到反应液；

s2.向得到的反应液中加入乳双歧杆菌bl-04和长双歧杆菌bl-05组成的复合益生菌，活菌总量为100×108cfu/g，添加量为3g/l反应液进行发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为9h，得到发酵液；

s3.将得到的发酵液依次通过微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜组合的串联膜浓缩得到浓缩液；

s4.将浓缩液滴入纳米乳清浓缩蛋白溶液中，在温度为20-25℃下涡旋振荡进行包埋，得到包埋溶液，该包埋溶液以33ml/min的加料速度在-40℃进行冷冻喷雾干燥，即得合生元。

所得合生元中低聚半乳糖的产率、益生菌的存活率、体外消化率等性能指标的结果如表1所示。

对比例1：

一种合生元的制备方法，包括如下步骤：

步骤s1.中，加入复配质量比为5：1的β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶的混合酶；其他同实施例1。

所得合生元中低聚半乳糖的产率、益生菌的存活率、体外消化率等性能指标的结果如表1所示。

对比例2：

一种合生元的制备方法，包括如下步骤：

步骤s1.中，加入复配质量比为60：1的β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶的混合酶；其他同实施例1。

所得合生元中低聚半乳糖的产率、益生菌的存活率、体外消化率等性能指标的结果如表1所示。

对比例3：

一种合生元的制备方法，包括如下步骤：

步骤s4.中，将浓缩液以33ml/min的加料速度在-40℃进行冷冻喷雾干燥；其他同实施例1。

所得合生元中低聚半乳糖的产率、益生菌的存活率、体外消化率等性能指标的结果如表1所示。

对比例4：

一种合生元的制备方法，包括如下步骤：

步骤s1.中，仅加入β-半乳糖苷酶，不添加葡萄糖氧化酶；其他同实施例1。

所得合生元中低聚半乳糖的产率、益生菌的存活率、体外消化率等性能指标的结果如表1所示。

对比例5：

一种合生元的制备方法，包括如下步骤：

步骤s1.中，加入复配质量比为3:1的β-半乳糖苷酶和酿酒酵母的混合物；其他同实施例1。

所得合生元中低聚半乳糖的产率、益生菌的存活率、体外消化率等性能指标的结果如表1所示。

表1