本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及一种牦牛冷冻精液稀释液及其制备方法。
背景技术：
：牦牛（学名：bosmutus或bosgrunniens，英文名称：wildyak），属于哺乳纲、真兽亚纲、偶蹄目、反刍亚目、牛科、牛亚科动物，是以中国青藏高原为中心，及其毗邻高山、亚高山高寒地区的特有珍稀牛种之一，草食性反刍家畜。牦牛能适应高寒气候，是世界上生活在海拔最高处的（除人类外）哺乳动物，分布于中国青藏高原海拔3000米以上地区。牦牛的藏语叫雅客，世界通称为“yak”，即藏语译音。牦牛叫声像猪鸣，所以又称猪声牛。西方国家因其主产于中国青藏高原藏族地区，也称西藏牛。牦牛尾如马尾，所以又名马尾牛。精液冷冻保存是将精液用含特殊冷冻保护剂和营养成分等的稀释液稀释后，保存于液氮或干冰中，以达到在体外长期保存精子的目的。精液在经过超低温冷冻解冻后，精子的活力降低、死亡数量与畸形率增加，其原因是精子受冷打击致使精子质膜结构发生改变，严重影响质膜的完整性及其复苏后的精子的活力及受精能力。目前，冷冻精液时需要在稀释液中加入冷冻保护剂、营养物质、盐、抗生素等成分，最常用的非渗透冷冻保护剂为卵黄，例如专利申请200510096117.5、202010744351.9等，卵黄虽然有长期的使用经验和较好的保护效果，但一方面其有机成分复杂，效果不稳定且不易制成商用成品，另一方面由于其为动物源性成分，有潜在的疾病传播风险。同时，由于卵黄中存在较多的脂类，在应用中存在黏度过大、蛋黄脂肪颗粒大而不均匀，影响精子运动速率的问题，且不利于冷冻解冻后的观察与操作等问题。因此如何克服现有技术的不足是目前生物工程
技术领域：
亟需解决的问题。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种牦牛冷冻精液稀释液及其制备方法，该冷冻精液稀释液不采用卵黄，无动物源成分，无传染或引起疾病的风险，可以明显提高精子冻后活率、顶体完整率，提高了精子冻后品质。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种牦牛冷冻精液稀释液的制备方法，包括如下步骤：步骤（1），采用双蒸水室温超声提取肉苁蓉，得到肉苁蓉提取液；双蒸水与肉苁蓉的质量比为100：1-5；步骤（2），将仙茅粉碎至粒径不超过2mm，然后采用双蒸水于45-60℃下浸提仙茅粉碎物，得到仙茅提取液；双蒸水与仙茅的质量比为500：2-7；步骤（3），将芡实浸泡过夜后，用双蒸水磨浆，过滤，滤液用双蒸水调整至密度为1.12±0.03g/cm3，得到芡实液；步骤（4），取步骤（1）得到的肉苁蓉提取液、步骤（2）得到的仙茅提取液、步骤（3）得到的芡实液、柠檬酸钠、葡萄糖、棉籽糖、白藜芦醇、谷氨酸二乙酸四钠、玉米低聚肽、二十二碳六烯酸、双蒸水一起混匀后，静置，过滤，再向滤液中加入青霉素和链霉素，混匀，采用双蒸水补足，即得到牦牛冷冻精液稀释液；所述的牦牛冷冻精液稀释液ph值在6.8-7.2；配制每100毫升冷冻稀释液中采用的物质如下：肉苁蓉提取液0.1-0.2ml、步骤（2）得到的仙茅提取液0.1-0.2ml、步骤（3）得到的芡实液0.1-0.2ml、柠檬酸钠1.3-1.5g、葡萄糖1.8-2.2g、棉籽糖0.1-0.15g、白藜芦醇0.002-0.005g、谷氨酸二乙酸四钠0.3-0.5g、玉米低聚肽1-2g、二十二碳六烯酸1-1.5g；以双蒸水为溶剂；每100毫升冷冻稀释液青霉素和链霉素的含量均为10万国际单位。进一步，优选的是，步骤（1）中，超声提取时间为30-60min。进一步，优选的是，步骤（2）中，浸提时间为6-8h。进一步，优选的是，步骤（3）中，芡实采用30-40℃的双蒸水浸泡。进一步，优选的是，步骤（4）中，静置时间为10-20min。进一步，优选的是，步骤（4）中，过滤采用0.45μm膜过滤。本发明同时提供上述牦牛冷冻精液稀释液的制备方法制得的牦牛冷冻精液稀释液。本发明中步骤（3）芡实液制备过程中，双蒸水用量不做具体限制，只要满足最终密度为1.12±0.03g/cm3即可。本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明引入肉苁蓉提取液仙茅提取液、芡实液来维持精子活性，以白藜芦醇为抗氧化剂、谷氨酸二乙酸四钠为螯合剂，用棉籽糖保证细胞膜保护功能，制得的牦牛冷冻精液稀释液可以明显提高精子冻后活率、顶体完整率，提高了精子冻后品质，且由于无动物源成分，所以不会产生传染或引起疾病的风险，易于推广应用。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本发明所述的肉苁蓉、仙茅、芡实均为普通市售干制品。实施例1一种牦牛冷冻精液稀释液的制备方法，包括如下步骤：步骤（1），采用双蒸水室温超声提取肉苁蓉，得到肉苁蓉提取液；双蒸水与肉苁蓉的质量比为100：3；步骤（2），将仙茅粉碎至粒径不超过2mm，然后采用双蒸水于50℃下浸提仙茅粉碎物，得到仙茅提取液；双蒸水与仙茅的质量比为500：5；步骤（3），将芡实浸泡过夜后，用双蒸水磨浆，过滤，滤液用双蒸水调整至密度为1.12±0.03g/cm3，得到芡实液；步骤（4），取步骤（1）得到的肉苁蓉提取液、步骤（2）得到的仙茅提取液、步骤（3）得到的芡实液、柠檬酸钠、葡萄糖、棉籽糖、白藜芦醇、谷氨酸二乙酸四钠、玉米低聚肽、二十二碳六烯酸、双蒸水一起混匀后，静置，过滤，再向滤液中加入青霉素和链霉素，混匀，采用双蒸水补足，即得到牦牛冷冻精液稀释液；所述的牦牛冷冻精液稀释液ph值在6.8-7.2；配制每100毫升冷冻稀释液中采用的物质如下：肉苁蓉提取液0.15ml、步骤（2）得到的仙茅提取液0.18ml、步骤（3）得到的芡实液0.13ml、柠檬酸钠1.4g、葡萄糖2.0g、棉籽糖0.13g、白藜芦醇0.004g、谷氨酸二乙酸四钠0.4g、玉米低聚肽1.5g、二十二碳六烯酸1.2g；以双蒸水为溶剂；每100毫升冷冻稀释液青霉素和链霉素的含量均为10万国际单位。实施例2一种牦牛冷冻精液稀释液的制备方法，包括如下步骤：步骤（1），采用双蒸水室温超声提取肉苁蓉，得到肉苁蓉提取液；双蒸水与肉苁蓉的质量比为100：1；步骤（2），将仙茅粉碎至粒径不超过2mm，然后采用双蒸水于45℃下浸提仙茅粉碎物，得到仙茅提取液；双蒸水与仙茅的质量比为500：2；步骤（3），将芡实浸泡过夜后，用双蒸水磨浆，过滤，滤液用双蒸水调整至密度为1.12±0.03g/cm3，得到芡实液；步骤（4），取步骤（1）得到的肉苁蓉提取液、步骤（2）得到的仙茅提取液、步骤（3）得到的芡实液、柠檬酸钠、葡萄糖、棉籽糖、白藜芦醇、谷氨酸二乙酸四钠、玉米低聚肽、二十二碳六烯酸、双蒸水一起混匀后，静置，过滤，再向滤液中加入青霉素和链霉素，混匀，采用双蒸水补足，即得到牦牛冷冻精液稀释液；所述的牦牛冷冻精液稀释液ph值在6.8-7.2；配制每100毫升冷冻稀释液中采用的物质如下：肉苁蓉提取液0.1ml、步骤（2）得到的仙茅提取液0.1ml、步骤（3）得到的芡实液0.1ml、柠檬酸钠1.3g、葡萄糖1.8g、棉籽糖0.1g、白藜芦醇0.002g、谷氨酸二乙酸四钠0.3g、玉米低聚肽1g、二十二碳六烯酸1g；以双蒸水为溶剂；每100毫升冷冻稀释液青霉素和链霉素的含量均为10万国际单位。步骤（1）中，超声提取时间为30min。步骤（2）中，浸提时间为6h。步骤（3）中，芡实采用30℃的双蒸水浸泡。步骤（4）中，静置时间为10min。步骤（4）中，过滤采用0.45μm膜过滤。实施例3一种牦牛冷冻精液稀释液的制备方法，包括如下步骤：步骤（1），采用双蒸水室温超声提取肉苁蓉，得到肉苁蓉提取液；双蒸水与肉苁蓉的质量比为100：5；步骤（2），将仙茅粉碎至粒径不超过2mm，然后采用双蒸水于60℃下浸提仙茅粉碎物，得到仙茅提取液；双蒸水与仙茅的质量比为500：7；步骤（3），将芡实浸泡过夜后，用双蒸水磨浆，过滤，滤液用双蒸水调整至密度为1.12±0.03g/cm3，得到芡实液；步骤（4），取步骤（1）得到的肉苁蓉提取液、步骤（2）得到的仙茅提取液、步骤（3）得到的芡实液、柠檬酸钠、葡萄糖、棉籽糖、白藜芦醇、谷氨酸二乙酸四钠、玉米低聚肽、二十二碳六烯酸、双蒸水一起混匀后，静置，过滤，再向滤液中加入青霉素和链霉素，混匀，采用双蒸水补足，即得到牦牛冷冻精液稀释液；所述的牦牛冷冻精液稀释液ph值在6.8-7.2；配制每100毫升冷冻稀释液中采用的物质如下：肉苁蓉提取液0.2ml、步骤（2）得到的仙茅提取液0.2ml、步骤（3）得到的芡实液0.2ml、柠檬酸钠1.5g、葡萄糖2.2g、棉籽糖0.15g、白藜芦醇0.005g、谷氨酸二乙酸四钠0.5g、玉米低聚肽2g、二十二碳六烯酸1.5g；以双蒸水为溶剂；每100毫升冷冻稀释液青霉素和链霉素的含量均为10万国际单位。步骤（1）中，超声提取时间为60min。步骤（2）中，浸提时间为8h。步骤（3）中，芡实采用40℃的双蒸水浸泡。步骤（4）中，静置时间为20min。步骤（4）中，过滤采用0.45μm膜过滤。实施例4一种牦牛冷冻精液稀释液的制备方法，包括如下步骤：步骤（1），采用双蒸水室温超声提取肉苁蓉，得到肉苁蓉提取液；双蒸水与肉苁蓉的质量比为100：3.8；步骤（2），将仙茅粉碎至粒径不超过2mm，然后采用双蒸水于52℃下浸提仙茅粉碎物，得到仙茅提取液；双蒸水与仙茅的质量比为500：5；步骤（3），将芡实浸泡过夜后，用双蒸水磨浆，过滤，滤液用双蒸水调整至密度为1.12±0.03g/cm3，得到芡实液；步骤（4），取步骤（1）得到的肉苁蓉提取液、步骤（2）得到的仙茅提取液、步骤（3）得到的芡实液、柠檬酸钠、葡萄糖、棉籽糖、白藜芦醇、谷氨酸二乙酸四钠、玉米低聚肽、二十二碳六烯酸、双蒸水一起混匀后，静置，过滤，再向滤液中加入青霉素和链霉素，混匀，采用双蒸水补足，即得到牦牛冷冻精液稀释液；所述的牦牛冷冻精液稀释液ph值在6.8-7.2；配制每100毫升冷冻稀释液中采用的物质如下：肉苁蓉提取液0.15ml、步骤（2）得到的仙茅提取液0.15ml、步骤（3）得到的芡实液0.15ml、柠檬酸钠1.4g、葡萄糖2g、棉籽糖0.12g、白藜芦醇0.004g、谷氨酸二乙酸四钠0.4g、玉米低聚肽1.5g、二十二碳六烯酸1.3g；以双蒸水为溶剂；每100毫升冷冻稀释液青霉素和链霉素的含量均为10万国际单位。步骤（1）中，超声提取时间为45min。步骤（2）中，浸提时间为7h。步骤（3）中，芡实采用35℃的双蒸水浸泡。步骤（4）中，静置时间为15min。步骤（4）中，过滤采用0.45μm膜过滤。检测：使用假阴道法采集牦牛精液，将精液与牦牛冷冻精液稀释液于37℃水浴锅中处理10min后，于冷冻管中将精液与稀释液按1:2的体积比进行稀释混匀后，向混合液中加入等体积的稀释液，混匀，放入4℃冰箱平衡1h，然后放入冷冻罐中保存。将冷冻管从液氮中取出后，在37℃水浴中静置50s，取样检测精子活力、顶体完整率和畸形率，结果如表1。表1活力，%顶体完整率，%畸形率，%实施例152.15±2.0195.25±2.379.5±1.73实施例248.67±1.3594.35±1.2410.5±0.82实施例351.65±0.5894.78±0.8511.3±1.15实施例452.37±0.9695.67±1.6610.4±0.69本发明制得的牦牛冷冻精液稀释液可以明显提高精子冻后活率、顶体完整率，提高了精子冻后品质，且由于无动物源成分，所以不会产生传染或引起疾病的风险，易于推广应用。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页1 2 3